研究人員實(shí)現(xiàn)纖維小體原位關(guān)鍵酶的純化及解析

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2018-02-05

作為熱纖梭菌纖維小體中含量最高的的關(guān)鍵酶組分，Cel48S的酶學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。團(tuán)隊(duì)前期通過核磁共振方法修正了文獻(xiàn)中關(guān)于Cel48S的組裝模塊的結(jié)構(gòu)，對纖維小體的組裝方式有了新認(rèn)識。

纖維小體是細(xì)菌分泌的高效降解木質(zhì)纖維素的多酶復(fù)合體，其高效降解機(jī)制及產(chǎn)纖維小體細(xì)菌的遺傳改造是木質(zhì)纖維素降解利用研究中的重要方向之一。熱纖梭菌的Cel48S是其纖維小體的主要外切葡聚糖酶，是其纖維小體中含量的組分，在纖維素降解過程中起關(guān)鍵作用。但Cel48S的內(nèi)在性質(zhì)使得對Cel48S的純化存在很大困難，文獻(xiàn)中對該酶的性質(zhì)鑒定報(bào)道存在諸多相互矛盾之處，與該酶在纖維小體中的重要作用并不相符，這使人們難以深入揭示纖維小體的高效降解機(jī)制。中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所代謝物組學(xué)團(tuán)隊(duì)研究員崔球與馮銀剛、副研究員劉亞君等，基于前期開發(fā)的熱纖梭菌遺傳改造工具，通過對纖維小體的定向改造，實(shí)現(xiàn)了對其原位Cel48S催化結(jié)構(gòu)域的高效純化，從而成功的對Cel48S的酶學(xué)與結(jié)構(gòu)性質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)解析，揭示Cel48S在纖維小體中的真正作用。相關(guān)成果在線發(fā)表在Biotechnology for Biofuels上。　　

木質(zhì)纖維素水解糖化是實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的高值利用的第一步，也是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。為了打破國外酶制劑技術(shù)壟斷、突破糖化技術(shù)瓶頸，代謝物組學(xué)團(tuán)隊(duì)致力于開發(fā)基于熱纖梭菌纖維小體的新型整合生物糖化技術(shù)路線。在這一路線框架下，需要通過對纖維小體這一多酶復(fù)合體的機(jī)制解析以及定向改良從而獲得高效的全菌催化劑。為此，代謝物組學(xué)團(tuán)隊(duì)針對梭菌系統(tǒng)地開發(fā)了非模式微生物基因操作工具，在熱纖梭菌中實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的基因敲除、過表達(dá)和精準(zhǔn)編輯，完成對熱線梭菌纖維小體腳架蛋白的功能貢獻(xiàn)、解除纖維小體反饋抑制的定向改造等系列工作。同時(shí)，團(tuán)隊(duì)建立了成熟的X射線晶體學(xué)和生物大分子核磁共振等蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析平臺，完成多個(gè)纖維小體組分和工業(yè)酶催化機(jī)制的研究。在完善的遺傳操作平臺和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析平臺的基礎(chǔ)之上，研究人員對纖維小體關(guān)鍵組分Cel48S進(jìn)行更系統(tǒng)深入的研究。

作為熱纖梭菌纖維小體中含量的的關(guān)鍵酶組分，Cel48S的酶學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。團(tuán)隊(duì)前期通過核磁共振方法修正了文獻(xiàn)中關(guān)于Cel48S的組裝模塊的結(jié)構(gòu)，對纖維小體的組裝方式有了新認(rèn)識。對于Cel48S的催化模塊，由于難于異源表達(dá)，與纖維小體結(jié)合緊密難以從原位分離，文獻(xiàn)中對其性質(zhì)的報(bào)道相互矛盾，該酶在纖維小體中的真正作用并未得到有效闡明。為了解決這一問題，研究人員使用前期建立的熱纖梭菌精準(zhǔn)遺傳操作工具，通過在Cel48S的催化結(jié)構(gòu)域后面插入編碼組氨酸標(biāo)簽和終止密碼子的序列，實(shí)現(xiàn)了將Cel48S的催化結(jié)構(gòu)域從纖維小體中分離并從培養(yǎng)物上清中的一步直接純化。在此基礎(chǔ)上，通過酶學(xué)測定和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，確定天然Cel48S的高活性、結(jié)晶纖維素的底物偏好以及底物偶聯(lián)的誘導(dǎo)契合效應(yīng)，闡明纖維小體關(guān)鍵組分Cel48S的結(jié)構(gòu)功能特性。同時(shí)，該研究提供了基于精準(zhǔn)遺傳操作實(shí)現(xiàn)分離純化原位的纖維小體或其他分泌蛋白的方法，為進(jìn)一步研究纖維小體木質(zhì)纖維素降解機(jī)制及構(gòu)建木質(zhì)纖維素糖化的定向改良菌株提供了范例和基礎(chǔ)。

相關(guān)系列研究得到了國家科技支撐計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金委員會(huì)以及山東省糖產(chǎn)業(yè)科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)盟建設(shè)任務(wù)的資助。

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