卒中、心肌梗死、深靜脈血栓塞 (DVT)及相關(guān)并發(fā)癥等心腦血管疾病已成為影響公眾健康的主要?dú)⑹种?。在美國(guó)，每年約有20萬血管栓塞的新增病例；西歐則有超過100萬人患病，有37萬人死于血管栓塞及其相關(guān)疾病。該病的發(fā)病率也與年齡相關(guān)，在30-49歲，血管栓塞的發(fā)病率為每千人中2人發(fā)病，但在70-79歲之間則達(dá)到了每千人中20人發(fā)病。
在利伐沙班出現(xiàn)之前，臨床經(jīng)常使用的抗凝藥物為維生素K類抗凝劑及肝素，但它們均存在局限性，開發(fā)強(qiáng)效、穩(wěn)定、耐受性好的的新型口服小分子抗凝藥是研究的熱點(diǎn)。而活化因子FXa (Factor Xa)受到了人們的關(guān)注，它是一種絲氨酸蛋白酶，可將凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，是一個(gè)極具價(jià)值的抗凝作用靶點(diǎn)，它在內(nèi)源性和外源性兩條凝血途徑的會(huì)聚點(diǎn)發(fā)揮作用，處于內(nèi)源或外源通路的中心位置，現(xiàn)已成為開發(fā)新一代抗凝藥物的主要靶點(diǎn)。FXa抑制劑則可阻止凝血酶的突增，減少凝血酶誘導(dǎo)的凝血和血小板的激活，且無傳統(tǒng)抗凝劑所具有的局限性 。
FXa抑制劑的發(fā)現(xiàn)與設(shè)計(jì)
在1987年，第一個(gè)FXa抑制劑——Antistasin，在墨西哥水蛭中分離出來。1990年，又有人在蜱蟲中分離出蜱蟲抗凝多肽(TAP)。與Antistasin類似，TAP也是FXa的強(qiáng)效抑制劑，凝血實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)Xa在體外能夠活化凝血酶原促使形成凝集，F(xiàn)Xa抑制劑具有很強(qiáng)的抗凝血作用，并且治療窗口較寬，具有成為新一代抗凝藥物的潛力。
1998年，拜耳公司組建研發(fā)團(tuán)隊(duì)開始著手小分子FXa抑制劑的研究，經(jīng)過對(duì)200000種化合物的高通量篩選，得到苗頭化合物1——通過組合化學(xué)庫得到的含有磷酸鹽基團(tuán)的小分子化合物，它的IC50 值為70nM。將其中的磷酸鹽基團(tuán)由脒基替換，形成苗頭化合物2，它的IC50 值為120nM。
為了降低脒基的堿性和離解性，變換成弱堿性或中性基團(tuán)，使其有利于吸收，增加化合物活性，研發(fā)人員合成了異吲哚啉類化合物3與4，它們的IC50值分別為2nM與8nM。雖然它們的IC50值足夠小，但是生物利用度也是很低，這就極大阻礙了化合物藥效的發(fā)揮。
故而，在此基礎(chǔ)上又合成了活性稍低的化合物5，該化合物的IC50 值為48 nM，在大鼠實(shí)驗(yàn)中，測(cè)得其口服生物利用度為38%。雖然生物利用度提高了，但是整體效果仍然不理想。
合成了諸多化合物都未達(dá)到理想狀態(tài)，研發(fā)人員不得不重新考慮一味地尋找活性高的化合物這一思路是否正確。為了驗(yàn)證化合物基團(tuán)的重要性，他們總結(jié)得出苯脒基并不是必要的，化合物3,4,5均沒有這一基團(tuán)。利用構(gòu)效關(guān)系得出，這些化合物右邊的氯噻吩甲酰胺基則是非常重要的。于是，他們重新關(guān)注那些活性低的化合物，以期發(fā)現(xiàn)有用的化合物。
在二次篩查后，他們發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)惡唑烷酮類化合物6與7。其中化合物6是很弱的FXa抑制劑，其IC50值為20000nM。7與6的不同在于7化合物中的噻吩上的氫原子被氯原子取代，這樣，它的IC50值提高了200多倍，為90nM。雖然它們的活性不高，但是這類化合物有很好的生物利用度。通過這兩個(gè)例子可以說明：噁唑烷酮片段對(duì)整個(gè)化合物的影響是有利的，因?yàn)樗岣吡嘶衔锏娜芙庑耘c生物利用度；噻吩環(huán)的氯代對(duì)提高化合物的生物活性也很重要。于是，研發(fā)人員將化合物7作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行進(jìn)一步地優(yōu)化。
用嗎啉環(huán)置換硫代嗎啉環(huán), 化合物8活性提高近2倍, IC50為32nM；用四氫吡咯替換, 化合物9的IC50為40nM。雖然化合物8沒有最強(qiáng)的活性，但它展示了最完美的藥物動(dòng)力學(xué)結(jié)果，口服生物利用度高達(dá)94%。
在嗎啉環(huán)與四氫吡咯中引入羰基，得到化合物10與11。引入羰基之后，化合物活性明顯提高，生物利用度降低的也不多?；衔?0與11的IC50 值分別為4nM與0.7nM；它們的口服生物利用度分別為65%與60%。但是在大鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)在，化合物10的活性卻變低了，而化合物11無論在體內(nèi)還是在體外實(shí)驗(yàn)均表現(xiàn)出良好的活性。且11的R對(duì)映體的 IC50 = 2300nM，證明S構(gòu)型是構(gòu)型。因此，最終的候選化合物為11，這也是后來的首個(gè)口服FXa抑制劑——利伐沙班(rivaroxaban)。該藥在2008年9月在歐盟和加拿大上市，2011年7月由美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。
利伐沙班與FXa的構(gòu)效關(guān)系
為了理解驗(yàn)證利伐沙班與FXa的相互作用，X射線衍射提供了很大的幫助，它有助于幫助解決利伐沙班與FXa的構(gòu)效關(guān)系問題。
在晶體結(jié)構(gòu)中，利伐沙班與Gly219 形成兩個(gè)重要的氫鍵，惡唑烷酮的羰基與Gly219形成強(qiáng)氫鍵結(jié)合 (2.0Å)，氯代噻吩環(huán)上酰胺的 NH 與 Gly219形成弱氫鍵結(jié)合 (3.3Å)。這兩個(gè)氫鍵支持著惡唑烷酮進(jìn)入FXa的S1與S4口袋，這就導(dǎo)致了S 構(gòu)型的惡唑烷酮采取了 L-形狀的構(gòu)象。
FXa中的Tyr99,Phe174 與Trp215組成包含S4的狹窄疏水口袋，利伐沙班的嗎啉酮部分正好“夾在”Tyr99和Phe174之間，而其芳基環(huán)取向垂直地延伸穿過Trp215的表面。嗎啉酮羰基和FXa 沒有直接相互作用關(guān)系，只是有助于嗎啉酮的平面化，使得嗎啉酮部分更好地進(jìn)入口袋。
氯代噻吩環(huán)結(jié)合于 S1 腔，氯原子與 Tyr228 的苯環(huán)發(fā)生鹵素-π 電子的相互作用，與 Asp189 在S1 腔中形成的靜電相互作用。這顯然增加利伐沙班的活性與生物利用度。
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