近兩年來，基因療法領域取得了重大突破，2017年底，明星基因療法公司Spark Therapeutics開發(fā)的Luxturna獲得FDA批準上市，成為首款在美國獲批的“體內給藥型”基因療法。而諾華公司開發(fā)的Zolgensma也有望在本月獲得FDA批準，成為第二款“體內給藥型”基因療法。根據(jù)再生醫(yī)學聯(lián)盟（ARM）發(fā)布的報告，截至到2019年第一季度末，全球有371項基因療法處于臨床開發(fā)階段，與2018年同期相比，增長了17%。

        作為遞送基因療法的有力工具，腺相關病毒（AAV）的開發(fā)和制造也成為業(yè)界的關注焦點之一。近日多家公司通過合作和并購，擴展AAV的設計和制造能力。日前，Nature Reviews Drug Discovery上發(fā)表一篇綜述，通訊作者是馬薩諸塞大學醫(yī)學院（University of Massachusetts）的基因療法專家高光坪教授。這篇綜述對這一基因療法遞送平臺進行了詳細介紹，今天藥明康德的微信團隊將與讀者分享這篇文章的精彩內容。

        腺相關病毒基本構造和作為基因療法載體的運作機理

        腺相關病毒是一種單鏈DNA病毒，目前的科學界共識是它不會導致任何人類疾病。它由蛋白衣殼（capside）和長度為4.7kb的單鏈DNA基因組構成。蛋白衣殼由三個亞基組成，分別為VP1，VP2，和VP3。AAV基因組兩端為兩個“T”型的末端反向重復序列（inverted terminal repeat, ITR）。這兩個ITRs是病毒DNA復制的起點和觸發(fā)病毒包裝的信號。AAV基因組中的rep基因編碼4個與病毒復制相關的蛋白，分別為Rep78、Rep68、Rep52、和Rep40。

        作為基因療法載體的重組腺相關病毒（rAAV）攜帶的蛋白衣殼與野生型AAV幾乎完全相同，然而衣殼內的基因組中編碼病毒蛋白的部分完全被刪除，取而代之的是治療性轉基因（transgene）。AAV基因組中唯一被保留的部分是ITRs，它起到指導基因組的復制和病毒載體組裝的作用。將編碼病毒蛋白的部分完全刪除的優(yōu)點是：一方面可以化重組AAV攜帶轉基因的容量，另一方面減小體內遞送轉基因時產(chǎn)生的免疫原性和細胞**。

        重組AAV顆粒通過與宿主細胞表面表達的糖化受體相結合，通過網(wǎng)格蛋白（clathrin）介導的內吞作用進入細胞。在內吞形成的內體（endosome）酸化之后，病毒衣殼的VP1/VP2部分構象發(fā)生變化，導致病毒從內體中脫離，并且通過核孔進入細胞核。進入細胞核后，單鏈DNA從衣殼中釋放出來。這時單鏈DNA還不能進行轉錄，它們需要變成雙鏈DNA。單鏈DNA可以利用宿主細胞的DNA聚合酶來合成互補鏈，或者兩條從不同AAV顆粒中釋放的互補鏈退火（annealing）形成雙鏈DNA。

        最新的AAV基因組設計能夠將衣殼中攜帶的單鏈DNA設計成自我互補（self-complementary）的序列。這種序列的優(yōu)點在于它不需要單鏈DNA復制成為雙鏈DNA的步驟就可以進行轉錄，與傳統(tǒng)的單鏈AAV基因組相比，它的基因表達更為迅速，而且表達量更高。諾華公司開發(fā)的治療脊髓性肌肉萎縮癥（SMA）的Zolgensma就使用了這種基因組設計。然而這種設計的一個缺點是AAV攜帶的轉基因容量減半。

        雙鏈形式的AAV基因組然后利用ITRs進行分子內或分子間基因組重組，這一過程讓AAV基因組成為穩(wěn)定的游離DNA（episomal DNA），導致基因組能夠在不再進行有絲分裂的細胞中持續(xù)進行基因表達。

        AAV載體的轉化應用

        截至2018年11月13日，在ClinicalTrials.gov上有145項干預性臨床試驗中使用重組AAV載體。目前，兩款重組AAV載體已經(jīng)獲得批準在患者身上使用，它們是uniQure公司開發(fā)的Glybera（AAV1）和Spark Therapeutics公司開發(fā)的Luxturna（AAV2）。而諾華公司開發(fā)的Zolgensma（AAV9）可能在本月加入獲批療法的行列。

        目前，大約有10來種不同血清型的AAV在臨床試驗中作為基因療法的載體，基于AAV2的基因遞送平臺雖然仍然是最多的，但是諸如AAV8，AAV9和AAVrh.10等新一代衣殼正在臨床試驗中得到更多應用。下面我們來看一看這些臨床試驗的特征。

        重組AAV載體遞送基因的靶向組織

        大部分基因療法研發(fā)項目的靶向組織是肝 臟、橫紋肌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。幾乎所有天然AAV衣殼蛋白能夠在肝 臟中引發(fā)有效的轉基因表達，因此靶向肝 臟的重組AAV為治療一系列疾病提供了優(yōu)良的基因遞送平臺。它們包括A型和B型血友病、家族性高膽固醇血癥等疾病。

        AAV8和AAV9衣殼蛋白能夠靶向身體中的多種肌肉類型，這讓AAV介導的基因療法能夠用于治療多種肌肉疾病，其中包括杜興氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）。值得一提的是，肌肉可以作為生成治療性分子的“體內工廠”，因此靶向肌肉組織的基因療法可以用于治療非肌肉疾病。

        重組AAV遞送的基因療法的另一個重要方向是CNS，包括眼睛和大腦。眼睛是一個相對隔離的環(huán)境，直接進行眼內注射遞送AAV基因療法能夠達到治療多種遺傳性眼病的效果。Spark Therapeutics公司開發(fā)的獲批療法Luxturna就是治療由于RPE65基因突變而導致失明的患者。

        而靜脈輸入的AAV9和AAVrh.10能夠穿越血腦屏障，在神經(jīng)元和膠質細胞中引發(fā)轉基因表達。這項重大發(fā)現(xiàn)帶來多項針對CNS疾病的研究，其中包括SMA，肌萎縮側索硬化癥（ALS），GM1神經(jīng)節(jié)苷脂病，和粘多糖貯積癥III型等等。

        AAV基因療法策略

        基因替代：這一策略的目標是遞送表達正常蛋白的基因來彌補功能喪失性突變的影響。它適用于治療隱性單基因疾病，已經(jīng)臨床試驗中獲得極大成功。Glybera和Luxturna就是很好的例子。Glybera基于重組AAV1平臺遞送表達編碼脂蛋白脂肪酶（LPL）的轉基因，它用于治療LPL缺失患者。而Luxturna則使用AAV2平臺來遞送正常RPE65基因。這兩款療法都使用局部注射的施藥方法，分別注射到患者的肌肉和眼睛中。

        新一代AAV血清型的發(fā)現(xiàn)讓研究人員可以通過靜脈注射AAV載體將轉基因遞送到全身。這些新的AAV載體為治療A型和B型血友?。ò邢蚋?臟），DMD（靶向全身肌肉）和SMA（廣發(fā)靶向CNS，包括脊髓）帶來了有效療法。本月有望獲批的Zolgensma就是一個范例，這是一款利用AAV9載體遞送編碼運動神經(jīng)元生存蛋白（SMN）的SMA轉基因的基因療法。在很多疾病中，只需在部分細胞中表達正?；蚓妥阋跃徑饧膊〉陌Y狀。

        基因沉默：與基因替代相反，基因沉默的目標是治療由于功能獲得性基因突變導致的單基因疾病，例如亨廷頓?。℉untington disease）。RNAi療法目前是AAV基因沉默平臺的首選策略。然而，與合成RNAi療法的飛速進展相比，基于AAV遞送平臺的RNAi療法目前仍處于臨床前開發(fā)階段?；虺聊枰诖蟛糠纸M織中發(fā)生才能夠起到有意義的治療效果，在某些器官中（例如大腦），這對于AAV載體來說還是一個挑戰(zhàn)。

        在RNAi策略以外，使用CRISPR-Cas系統(tǒng)來靶向RNA也是一種基因靜默的策略。不過這一策略需要克服的障礙是重組AAV容納的轉基因大小有限，而且從細菌中發(fā)現(xiàn)的Cas蛋白可能引發(fā)免疫反應，從而降低療效。

        遞送新基因：除了治療單基因疾病以外，AAV介導的基因療法具有通過遞送新基因來治療復雜遺傳病或者傳染病的潛力。例如，心力衰竭和傳染病代表著具有高度未經(jīng)需求的疾病領域，通過引入新基因，基因療法可以提供生長因子，調節(jié)與心力衰竭相關的信號通路，以及表達中和致命病毒感染的抗體。目前的臨床試驗正在檢驗，使用肌肉作為生成治療性抗體的“生物工廠”，治療HIV感染的治療方法。

        改進AAV載體的手段

        當重組AAV在20多年前第一次表現(xiàn)出作為基因療法載體的臨床活性之后，研究人員就在不斷對衣殼蛋白進行改造，試圖賦予它新的功能和特征。隨著科技的進步，開發(fā)新衣殼蛋白的策略也不斷演變。

        目前，衣殼蛋白開發(fā)的策略可以分為3大類：天然發(fā)現(xiàn)，理性設計，和定向進化。隨著近年來計算能力和生物信息學預測模型的進展，一個新的衣殼蛋白設計分支出現(xiàn)了。這就是計算機發(fā)現(xiàn)（in silico discovery）策略。下面我們來看一看這些不同策略的優(yōu)缺點。

        天然發(fā)現(xiàn)

        目前有臨床應用潛力的AAV血清型都是從天然來源中分離出來的。其中的范例就是AAV9，它是從人類肝組織中分離出來的。AAV9具有穿越血腦屏障的能力，這讓它成為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中遞送基因療法的首選衣殼。除了能夠感染CNS的AAV血清型以外，天然人類和非人靈長類（NHP）AAV感染的主要器官為肝 臟和脾 臟。

        然而，使用人類AAV衣殼的一個缺陷是大部分人由于在一生中受到過AAV的感染，導致他們體內攜帶針對AAV衣殼的抗體。據(jù)傳染病學統(tǒng)計，40-80%的人體內攜帶針對AAV的抗體。這可能導致AAV作為基因療法載體在未遞送轉基因時就被免疫系統(tǒng)摧毀，降低轉基因的表達水平。

        解決這一難題的策略包括使用從非人靈長類中分離的AAV衣殼，以及其它脊椎動物中分離的AAV衣殼蛋白。目前，從非人靈長類動物和豬身上獲取的AAV衣殼種類在實驗中表現(xiàn)出良好的轉基因遞送能力。

        理性設計

        理性設計是改良病毒載體衣殼的首選策略之一。最初的改良策略包括將特定多肽序列嫁接在衣殼表面，讓它們可以與特定細胞表面的受體相結合。這可以讓病毒載體感染原先無法被感染的細胞。

        另一個改良病毒載體衣殼的方向是擾亂細胞對衣殼蛋白的降解過程。已有研究表明，通過點突變改變衣殼表面酪氨酸可以在小鼠模型中將轉基因在肝細胞中的表達水平提高30倍。這一改變不但抑制了蛋白酶體對AAV衣殼的降解，而且改善了病毒載體在細胞內的運輸。

        定向進化

        由于我們對AAV與細胞表面受體結合，內化，在細胞內運輸，以及進行基因表達的生理過程還不夠了解，這方面知識的缺陷限制了理性設計的應用。因此，定向進化手段在很多情況下成為優(yōu)化病毒載體更有效的策略。

        定向進化的原則是模擬自然進化的機制，在衣殼蛋白中引入大量隨機突變，然后在選擇壓力下篩選出具有特定生物性質和特征的衣殼。例如，它們可能可以靶向特定組織，或者逃避免疫監(jiān)控，或者提高轉基因的表達。這一策略的優(yōu)點在于我們不需要對相應的分子機制有深入的了解。

        目前，通過容易出錯的PCR可以在編碼衣殼蛋白的基因中引入大量隨機突變，從而建立一個具有豐富多樣性的衣殼蛋白庫。另一種建立多樣性衣殼蛋白庫的方法是將不同種類的天然衣殼蛋白中的不同部分隨機組合起來構成嵌合衣殼蛋白。

        隨著下一代測序技術（NGS）的進步，定向進化手段成為更為強大的發(fā)現(xiàn)創(chuàng)新病毒載體衣殼的方法?；贜GS開發(fā)的篩選技術如今可以每次對上千種攜帶不同衣殼的病毒載體進行篩選，從而迅速迭代，發(fā)現(xiàn)能夠在特定細胞或組織中導致基因表達的衣殼蛋白。

        In silico生物信息學發(fā)現(xiàn)策略

        生物信息學和計算機工具可以通過比較不同AAV的衣殼蛋白序列，推斷出衣殼蛋白的進化過程，并且發(fā)現(xiàn)衣殼蛋白上具備高度多樣性的區(qū)域。這可以幫助在這些區(qū)域引入變異，與定向進化手段相結合，更有效地篩選出新型病毒衣殼蛋白。

        結語

        基因療法是獲得業(yè)界關注的創(chuàng)新治療平臺。而作為遞送轉基因的有力手段，AAV載體平臺的研發(fā)也在出現(xiàn)指數(shù)型增長。雖然對AAV的研究屬于病毒學領域，但是將AAV轉化為基因療法載體的過程需要多學科的聯(lián)合研究。分子生物學、生物信息學、傳染病學、結構生物學、免疫學、和基因組學等方面的突破對AAV載體平臺的成功開發(fā)都起到不可或缺的作用。

        AAV載體平臺的發(fā)展仍然需要克服多項挑戰(zhàn)，其中包括如何經(jīng)濟有效地生成足夠數(shù)量的治療性AAV載體，以及克服人體免疫系統(tǒng)對AAV載體和轉基因產(chǎn)物的免疫排斥作用?？朔@些挑戰(zhàn)對推廣AAV介導的基因療法具有關鍵性的意義。

        我們期待隨著AAV研發(fā)領域的不斷擴展和多學科手段的應用，我們能夠克服目前遇到的挑戰(zhàn)，實現(xiàn)AAV基因療法的全部潛力。

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