第二部分：APOE基因變異，變了一個(gè)胺基酸，變了命運(yùn)

       3.APOE基因型與相應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)和功能

       APOE基因有三種常見的變異型，分別是E2, E3和E4變異型，互相之間，僅有一個(gè)核苷酸的區(qū)別。E3型最常見，約占65-70%的比例，而E4型約占15-20%，E2型占約5-10%。E3型被認(rèn)為是正常型，以E3型為參照，E4型顯著增加老年癡呆癥風(fēng)險(xiǎn)，而E2型微小減弱風(fēng)險(xiǎn)。我們先從分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的角度來(lái)看發(fā)生了什么？apoE蛋白分子上有兩個(gè)重要功能區(qū)域，受體結(jié)合區(qū)域(LDL receptor binding domain)和油脂結(jié)合區(qū)域(lipid binding domain)。受體結(jié)合區(qū)域位于蛋白質(zhì)中部，富含帶正電荷的堿性胺基酸，有利于與帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面受體結(jié)合。油脂結(jié)合區(qū)域位于蛋白質(zhì)尾部（C-端）， 富含疏水胺基酸。APOE基因的E4和E2變異型表現(xiàn)為兩個(gè)位置上的胺基酸改變：E4變異使第130號(hào)位置從半胱胺酸Cys變?yōu)榫匪酇rg，而E2變異使第176號(hào)位置從精胺酸Arg變?yōu)榘腚装匪酑ys。也就是說(shuō)正常的E3型蛋白質(zhì)apoE3是130Cys,176Arg；高風(fēng)險(xiǎn)E4型蛋白質(zhì)apoE4是130Arg, 176Arg；而低風(fēng)險(xiǎn)E2型蛋白質(zhì)apoE2是130Cys, 176Cy。這些胺基酸改變會(huì)造成什么樣的功能變化呢？

       第一，簡(jiǎn)單的從胺基酸層面看，我們不難看出，apoE4在130號(hào)位置增加了一個(gè)正電荷胺基酸Arg，而apoE2在176號(hào)位置損失了一個(gè)正電荷胺基酸Arg。有趣的是，第130和176號(hào)位置分別位于apoE蛋白質(zhì)的受體結(jié)合區(qū)域的兩側(cè)。apoE受體結(jié)合核心區(qū)域位于152-168號(hào)位置，這個(gè)區(qū)域富含帶正電荷的堿性胺基酸，用于與富含負(fù)電荷胺基酸的受體結(jié)合。apoE2蛋白質(zhì)在靠近受體結(jié)合區(qū)域位置上失去了一個(gè)正電荷胺基酸。實(shí)驗(yàn)證明apoE2與其在肝細(xì)胞上的受體LDLR的結(jié)合能力卻實(shí)大大下降，只有正常的apoE3的2%。而apoE4蛋白質(zhì)在距受體結(jié)合區(qū)域稍遠(yuǎn)的位置上增加一個(gè)帶正電荷的胺基酸，apoE4其與受體的結(jié)合能力則比正常的apoE3微小增加。因此，如果用與受體的結(jié)合能力來(lái)評(píng)價(jià)功能改變，apoE3為正常型，apoE2為嚴(yán)重失活型，而apoE4為微弱增活型。在人群中我們則觀察到，攜帶有E2/E2純合子變異的人容易患一種稱為三型高血脂的疾病，此病的重要特癥是血液中乳糜微粒和其他脂蛋白殘?bào)w不能被肝細(xì)胞清除，所以也稱為殘?bào)w代謝病(remnant metabolic disorder)。更進(jìn)一步的觀察還發(fā)現(xiàn)，APOE基因上其他幾個(gè)在受體結(jié)合區(qū)域失去帶正電荷基酸的變異，也都會(huì)導(dǎo)致家族性三型高血脂癥，進(jìn)一步肯定了這一區(qū)域失去正電荷會(huì)系統(tǒng)性的損壞apoE與其受體的結(jié)合能力。apoE與受體的結(jié)合能力是apoE4>apoE3>>apoE2。僅從受體結(jié)合能力的角度，我們很難解釋為什么只微弱增加受體結(jié)合能力的E4變異會(huì)那么顯著的增加老年癡呆癥風(fēng)險(xiǎn)，而受體結(jié)合能力損失了90%的E2變異確只微弱減輕風(fēng)險(xiǎn)。因此我們推斷，apoE與受體結(jié)合的通道可能不是其主要的老年癡呆癥致病機(jī)制。

       第二，從蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的變化角度我們可以看到，E4變異會(huì)引起apoE4蛋白質(zhì)區(qū)域間出現(xiàn)新的鹽鍵。在130號(hào)位置引入一個(gè)帶正電荷的胺基酸Arg, 會(huì)導(dǎo)致一個(gè)特殊的新鹽鍵，這個(gè)鹽鍵恰好鎖住了apoE蛋白質(zhì)尾部的脂質(zhì)結(jié)合區(qū)域，使這一區(qū)域喪失了靈動(dòng)性，進(jìn)而影響了這一區(qū)域與油脂分子的結(jié)合能力和選擇性。見示意圖。逐一置換APOE基因上胺基酸的實(shí)驗(yàn)證明，僅有E4變異所在的位置才可能通過鹽鍵改變脂質(zhì)結(jié)合區(qū)域的構(gòu)像。這暗示E4變異造成脂質(zhì)結(jié)合區(qū)構(gòu)象的改變是唯一的和特殊的，其它位置上的胺基酸變化幾乎沒有可能獲得類似的構(gòu)象變化。在現(xiàn)實(shí)生活中，確實(shí)沒有發(fā)APOE基因上的其他突變?cè)黾永夏臧V呆癥風(fēng)險(xiǎn)。

       現(xiàn)在我們來(lái)看看因E4變異而鎖住尾部脂質(zhì)結(jié)合區(qū)域可能導(dǎo)致什么樣的功能變化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，apoE4脂蛋白微粒的含脂量比正常的apoE3少2-3倍。而apoE2雖然與受體的結(jié)合能力大為下降，但其含脂量不受影響，與正常的apoE3相當(dāng)。除了含脂量的多少外，apoE4更喜歡與甘油三酯親和，而與膽固醇及磷脂的親和力下降。apoE2和apoE3能更好的與膽固醇和磷脂親和。從脂蛋白含脂量的角度來(lái)看看，apoE4<

       4.APOE與淀粉樣蛋白斑塊形成假說(shuō)

       APOE是老年癡呆癥重中之重的風(fēng)險(xiǎn)基因, 有很多假說(shuō)試圖解釋APOE如何導(dǎo)致老年癡呆癥，這些假說(shuō)復(fù)蓋了幾乎所有可能的病因通道。這里我們只作重討論APOE可能通過什么樣的機(jī)理導(dǎo)致粉狀蛋斑塊沉積。我們知道攜帶APOE基因E4變異的患者不但發(fā)病時(shí)間早，腦中的淀粉樣蛋白沉積更多，斑塊的密度也更高?？梢圆聹y(cè)影響大腦中淀粉樣蛋白斑塊形成的途徑主要有三個(gè)：過度產(chǎn)生，清除受阻，聚合加速。因?yàn)閍poE是一個(gè)脂蛋白，并不直接參與淀粉樣蛋白的產(chǎn)生，那么擾亂清除和加速聚合沉積可能是最主要的機(jī)制。我們先來(lái)看看正常生理狀態(tài)下大腦中淀粉樣蛋白是如何產(chǎn)生和清除的。

       淀粉樣蛋白的生理功能尚不清楚。淀粉樣蛋白主要由神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生，神經(jīng)細(xì)胞中的淀粉樣蛋白前體APP經(jīng)由幾個(gè)酶的分步切割而產(chǎn)生一組長(zhǎng)度為30-51個(gè)胺基酸的短肽并釋放到細(xì)胞外，這些短肽稱為淀粉樣蛋白β多肽(amyloid β peptide, or Aβ)。最常見的Aβ短肽有兩種，Aβ40和Aβ42。Aβ40含40個(gè)胺基酸，是神經(jīng)細(xì)胞正常情況下主要產(chǎn)生的一種，這種短肽的水溶性更好，不易發(fā)生自身聚合。Aβ42含42個(gè)胺基酸，比Aβ40在C-端多了兩個(gè)胺基酸，遠(yuǎn)比Aβ40更容易發(fā)生聚合。分析老年癡呆癥病人腦中的斑塊發(fā)現(xiàn)，有的斑塊全部由Aβ42組成，有的斑塊則以Aβ42為主伴有少量的Aβ40。大多數(shù)Aβ短肽分子在細(xì)胞外間質(zhì)中的構(gòu)像是可溶性的球狀結(jié)構(gòu)，稱為可溶性Aβ。但在一定條件下，Aβ短肽，特別是Aβ42之間可以通過氫鍵反相聚合成形成有序的纖維狀寡聚體，再進(jìn)一步聚合成β片層結(jié)構(gòu)(β-sheet)。這些非常有序的片層結(jié)構(gòu)聚合物會(huì)越聚越大，因?yàn)槭杷鶊F(tuán)暴露于其表面而難溶于水，結(jié)果在細(xì)胞外間質(zhì)中形成看起來(lái)像淀粉一樣的沉淀物，這些沉淀物堆聚而成的斑塊稱為淀粉樣蛋白斑塊(amyloid β plaques)。這里β是指通過β片層結(jié)構(gòu)形成的淀粉樣蛋白斑塊。詳見示意圖示。

       絕大部分可溶性Aβ是通過血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)到血液中而被清除的。在血腦屏障上表達(dá)的脂蛋受體LRP1 被認(rèn)為是負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)可溶性Aβ進(jìn)入外周血液的主要通道。小鼠同位素標(biāo)記灌注實(shí)驗(yàn)顯示，LRP1轉(zhuǎn)運(yùn)可溶性Aβ的速度非?？欤⑶肄D(zhuǎn)運(yùn)Aβ40的速度比是轉(zhuǎn)運(yùn)Aβ42的速度快約兩倍。但是，如果有apoE同時(shí)存在，無(wú)論是高度脂質(zhì)化的apoE還是裸體apoE, 都會(huì)使可溶性Aβ的轉(zhuǎn)運(yùn)速度大為下降。我們前面講過，LRP1也是apoE的受體，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果似乎暗示，一旦apoE與LRP1結(jié)合，就會(huì)阻礙可溶性Aβ通過血腦屏障清除。我們前面講過，不同變異型apoE與受體的結(jié)合的能力是APOE4>APOE3>>APOE2，那么可以猜測(cè)，apoE與受體的結(jié)合能力越強(qiáng)，其阻礙可溶性Aβ通過LRP1通道清除出大腦的能力就越強(qiáng)，反之亦然。支持apoE阻礙可溶性Aβ清除的證據(jù)還來(lái)自小鼠基因剔出實(shí)驗(yàn)(APOE knockout mouse)。在老年癡呆癥模型小鼠上剔除APOE基因，腦中的淀粉樣蛋白斑塊會(huì)顯著減小。除了LRP1通道外，另一個(gè)在血腦屏障上表達(dá)的脂蛋白受體LRP2 （LDL receptor related protein2) ，可以轉(zhuǎn)運(yùn)與apoJ脂蛋白微粒結(jié)合的不溶性Aβ。LRP2基因及編碼apoJ的CLU基因都是老年癡呆癥風(fēng)險(xiǎn)基因。除了通過血腦屏障清除A?外，還有一部份Aβ，特別是不溶性Aβ，可能是通過與apoE脂蛋白結(jié)合，然后通過與細(xì)胞表面的脂蛋白受體結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞中，并在細(xì)胞內(nèi)的溶酶體中被降解掉。大腦中的星型膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes), 小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia)和神經(jīng)細(xì)胞上都表達(dá)LDLR和LRP1, 可以與apoE結(jié)合。另外，小膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦中的免疫細(xì)胞，還可以通過非特異性內(nèi)吞機(jī)制（phagocytosis)把淀粉樣蛋白斑塊內(nèi)吞到細(xì)胞中加以消化。與內(nèi)吞機(jī)制相關(guān)的基因ABCA7和TREM2基因也與老年癡呆癥風(fēng)險(xiǎn)強(qiáng)相關(guān)。

       前面我們分析了E4變異對(duì)蛋白質(zhì)三維構(gòu)象的改變。E4變異嚴(yán)重改變了蛋白質(zhì)尾部脂質(zhì)結(jié)合區(qū)域的靈活性，這一結(jié)構(gòu)變化使apoE4與極性的膽固醇分子和磷脂結(jié)合較差，導(dǎo)致apoE4脂蛋白微粒含脂量顯著下降。我們可以想象星型膠質(zhì)細(xì)胞合成apoE脂蛋白微粒并分泌到細(xì)胞外，與神經(jīng)細(xì)胞分泌到細(xì)胞外的Aβ短肽混合共處于細(xì)胞間質(zhì)，apoE脂蛋白上的油脂分子，特別是膽固醇，可能會(huì)與Aβ短肽上暴露于表面的疏水性胺基酸親合，從而打破Aβ短肽自身聚合的平衡點(diǎn)，影響淀粉樣蛋白的形成。就象結(jié)晶過程中當(dāng)溶液濃度達(dá)到臨界點(diǎn)時(shí)，還需要有晶種才能觸發(fā)結(jié)晶一樣。如果apoE脂蛋白上的膽固醇分子可以干擾Aβ聚合”晶核”形成，那么即便脂蛋白上微小變化就有可能顯著改變Aβ聚合最終產(chǎn)量。讓我們先回顧一下, apoE主要由星型膠質(zhì)細(xì)胞合成, 與同樣在星型膠質(zhì)細(xì)胞中合成的膽固醇和磷脂等油性分子一起形成HDL like脂蛋白微粒，并分泌到細(xì)胞外，其主要生理功能被認(rèn)為是為神經(jīng)細(xì)胞運(yùn)送膽固醇和磷脂，用于神經(jīng)細(xì)胞的維修和擴(kuò)增。膽固醇和磷脂都是極性油脂，就像洗滌劑一樣，可以乳化融合含有疏水基團(tuán)的分子。不難想象，apoE脂蛋白含脂量越高，乳化融合Aβ的容量越大，反之亦然。這樣，我們就可以解釋為什么apoE4因?yàn)楹康?，兼融Aβ的容量小，從而化解Aβ聚合“晶核“形成的能力就差。因此，Aβ更易在攜帶E4變異人群的大腦中聚合成淀粉樣蛋白斑塊。實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示，在飽和濃度的Aβ溶液中，加入脂質(zhì)化的apoE會(huì)大大推遲Aβ自身聚合反應(yīng)發(fā)生的時(shí)間。這里，apoE脂蛋白的作用是減慢聚合核的形成。更多實(shí)驗(yàn)顯示，膽固醇分子而不是磷脂分子，可以有效阻礙胰 腺中一種叫做Amylin 的淀粉樣蛋白聚合。并且膽固醇分子的前體分子lanosterol可以有效溶解眼睛白內(nèi)障中不溶的蛋白質(zhì)。包括Aβ淀粉樣蛋白在內(nèi)，這幾種不溶性蛋白質(zhì)都是β片層結(jié)構(gòu)形成的聚合物。

       支持apoE含脂量假說(shuō)的一個(gè)重要證據(jù)來(lái)自ABCA1基因。apoE的脂質(zhì)化程度主要受ABCA1基因調(diào)節(jié)。ABCA1是一種分子泵，其功能是將細(xì)胞中膽固醇導(dǎo)流到含有apoE或apoJ的HDL-like脂蛋白微粒上。激活A(yù)BCA1表達(dá)可以顯著增加apoE脂蛋白微粒的含脂量。ABCA1基因的表達(dá)受視黃酸受體(retinoid receptor X, RXR)調(diào)節(jié)。視黃酸是維生素A衍生物，化學(xué)合成的RXR拮抗劑以及活化的維生素A都能有效激活A(yù)BCA1基因表達(dá)。給老年癡呆癥模型老鼠喂食RXR激動(dòng)劑的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠腦中淀粉樣蛋白斑塊會(huì)在喂食RXR拮抗劑幾小時(shí)后開始大量清除。并且，ABCA1趨動(dòng)的淀粉樣蛋白清除依賴于APOE基因的表達(dá)，在APOE基因剔出的小鼠中不起作用。為什么這么有效的RXR激動(dòng)劑不用來(lái)治療人的老年癡呆癥呢？可惜將RXR激動(dòng)劑用于人體臨床實(shí)驗(yàn)時(shí)，雖然也觀察到淀粉樣蛋白斑塊清除，但是該激動(dòng)劑在很短的用藥時(shí)間里即造成病人血脂極度升高，不得終停止這項(xiàng)人體臨床試驗(yàn)。其他幾個(gè)能活化ABCA1表達(dá)的激動(dòng)劑藥物，在老年癡呆癥小鼠模型中也得到同樣的結(jié)果。ABCA1基因突變與老年癡呆癥密切相關(guān)，己經(jīng)發(fā)現(xiàn)這個(gè)基因的失活變異增加老年癡呆癥風(fēng)險(xiǎn)2-3倍，而ABCA1上的增活變異則能降低風(fēng)險(xiǎn)。

       除了以上APOE淀粉樣蛋白假說(shuō)外，有不少實(shí)驗(yàn)工作顯示，APOE基因E4變異增加大腦中負(fù)責(zé)免疫功能的膠質(zhì)小細(xì)胞的活性和炎癥反應(yīng)。另一些證據(jù)則指向，表達(dá)E4的神經(jīng)細(xì)胞會(huì)生產(chǎn)更多容易聚合的Aβ42。并且?guī)в蠩4的神經(jīng)細(xì)胞對(duì)淀粉樣蛋白堆積更敏感，更容發(fā)生細(xì)胞凋亡和壞死。有趣的是，如果攜帶E4變異的人在運(yùn)動(dòng)中發(fā)生腦震蕩或腦部受傷，他們會(huì)比攜帶正常E3型的人需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能恢復(fù)。

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