克里唑替尼是FDA批準的首 個非小細胞肺癌精準藥物，也是腫瘤藥物研發(fā)史上開發(fā)最快的四大傳奇藥物之一。2006年，克里唑替尼被發(fā)現(xiàn)對攜帶EML4-ALK融合基因表達的腫瘤細胞具有抑制作用，并開始I期臨床試驗，2011年克里唑替尼通過快速通道被FDA批準上市，并引發(fā)轟動，主導發(fā)明人華裔女科學家崔景榮博士也因此榮獲第38屆美國國家發(fā)明者年度獎，每年全美各行業(yè)中只有一個專利可獲此殊榮。

       克里唑替尼的研發(fā)歷程既有偶然的成分也有必然的成分，偶然的是克里唑替尼本是基于c-Met激酶結構進行設計的，卻對ALK激酶具有強效的抑制活性，而必然的是由苗頭化合物向先導化合物過度時是依據(jù)傳統(tǒng)的藥物化學和構效關系為策略進行的，同時利用復合物晶體結構對結構進行“量體裁衣”式的優(yōu)化，后期則用親親脂性效率對成藥性進行全程“監(jiān)視”。“變幻莫測”卻“有的放矢”就是科學的魅力所在。

       01

       苗頭化合物到先導化合物的過度

       輝瑞研發(fā)的舒尼替尼于2006年上市，該藥對多種酪氨酸激酶均有較強的抑制活性，故可用于治療對伊馬替尼耐藥的胃腸道間質瘤患者。循此研發(fā)路徑，輝瑞繼續(xù)著手研發(fā)與其他激酶有關的腫瘤藥物。間充質上皮轉化因子激酶 (c-Met) 也是受體酪氨酸激酶，其信號通路對發(fā)育、器官形成和機體穩(wěn)態(tài)起著重要作用，因此c-Met被認為是腫瘤藥物治療的重要靶標。

       考慮到羥基吲哚的N-H和C=O結構可與激酶通過氫鍵結合，故輝瑞對具有羥基吲哚結構的化合物進行篩選發(fā)現(xiàn)，衍生物1對c-Met激酶具有較強的抑制活性(IC50=10 nmol·L-1)，且在1 μmol·L-1濃度下可因抑制c-Met而完全阻止A549細胞的生長，故認為衍生物1具有較好的開發(fā)潛能。

       為了提高該衍生物對c-Met激酶的選擇性，研究人員分別在母核的4位或5位分別引入取代苯基和芐基磺酰基側鏈，設計并合成了一系列衍生物。

       對合成近千個化合物進行活性測定發(fā)現(xiàn)，衍生物4對c-Met激酶具有較高的選擇性，強于對其他激酶抑制活性的50倍以上，且對c-Met激酶的抑制活性亦較高(IC50=9 nmol·L-1)；體內實驗表明，化合物4能抑制移植性腫瘤細胞的c-Met磷酸化，其活性參數(shù)測定結果為：配體效率LE=0.25、親脂性效率LipE=4.85、分布系數(shù)logD=3.20，故化合物4可作為候選化合物進入開發(fā)階段。

       02

       結構生物學揭示復合物的微觀結合特征

       通過對化合物4與c-Met激酶的復合物晶體結構分析發(fā)現(xiàn)：(1) 結合域的 A-環(huán)套采取了獨特的自身抑制狀態(tài)的構象，即在激酶的活化環(huán)套殘基1222～1227形成轉折，占據(jù)了αC螺旋的催化位置，使得1228～1245環(huán)套殘基移位，干擾了ATP 與底物的結合；(2) 吲哚酮的N-H和C=O基團與激酶的殘基分別形成氫鍵；(3) 吲哚酮的C=O與吡咯環(huán)的N-H形成分子內氫鍵，因而吲哚酮與吡咯環(huán)形成較大的共軛平面，處于ATP的腺嘌呤環(huán)結合的平面裂隙處；(4) 連接羥基吲哚與二氯苯基的連接基磺酰亞甲基形成U-形轉折，使二氯代芐基與具有獨特構象的A-環(huán)套上Tyr1230的苯酚環(huán)發(fā)生π-π堆積作用；(5) 磺酰基的氧原子與 Asp1222的N-H形成氫鍵，穩(wěn)定了分子取向；(6) 與吡咯環(huán)相連的酰胺及延伸的片段進入了水相，未與蛋白結合。

       03

       基于c-Met酶結構的分子設計

       基于骨架躍遷的母核優(yōu)化

       從結合信息可知，二氯苯基為了可與Tyr-1230發(fā)生π-π堆積作用，磺酰亞甲基自行進行U-形轉折，可能是由于二氯苯基、吲哚酮及吡咯環(huán)形成的共軛平面過大，故需縮小其基本骨架?；诠羌苘S遷原理，首先將吲哚酮與吡咯的分子內氫鍵“固化”成共價鍵，為氮雜吖啶5；隨后切斷C-N鍵形成2-氨基-3-苯基吡啶化合物6；最后進一步簡化連接基團，得到衍生物7。

       新骨架的首輪優(yōu)化

       雖然衍生物7對c-Met激酶的抑制活性較弱Ki=3.83μmol·L-1，但是由于分子量比較低，其配體效率優(yōu)于5 (LE=0.29)，但親脂性效率有所降低(LipE=0.35)。故可在衍生物苯環(huán)的羥基處引入極性側鏈，引入嗎啉亞乙基得到衍生物8，活性略有提高(Ki=2.45 μmol·L-1)，但是降低了配體率，隨后模仿衍生物4的片段，得到9，抑制活性和親脂性效率均有所提高，Ki=0.46μmol·L-1，LE=0.24，LipE=3.70。

       二氯苯基的取代基的變換和連接基亞甲基的甲基取代

       為了考察環(huán)上取代基對活性Ki和親脂性效率LipE的影響，在苯環(huán)上引入一個或多個、相同或不同的鹵素，連接鏈或用甲基取代、或不取代，合成了一系列通式10的衍生物，活性測定發(fā)現(xiàn)，衍生物11的活性最高，對c-Met酶的活性參數(shù)為：Ki=0.012μmol·L-1、LipE=4.82；對c-Met細胞的活性參數(shù)為：IC50=0.020μmol·L-1、 LipE=4.60。

       5-苯環(huán)的變換

       根據(jù)復合物的晶體結構，5-苯基結合于Tyr1159、Ile1084和Gly1163構成的疏水性狹窄裂隙，這需要確保在氨基吡啶的5位連接的芳環(huán)具有平面性，芳基上連接的基團延伸到溶劑相中。此外，11中的酰胺片段已離開疏水裂隙，進入水相，提示延伸的親水性片段可不必經(jīng)酰胺鍵連接。

       用五元含氮芳環(huán)替換5-苯環(huán)可增加水溶性，例如含5-吡唑或咪唑化合物的 cLogD比相應的苯化合物低2個單位，并且較小扭角，增加了共面性，有利于結合。氨基吡啶與吡唑環(huán)的連接方式對活性影響很大，例如化合物12和13的活性以及 LipE 值相差很大。結構生物學表明，12的吡唑環(huán)氮原子所處的位置使得c-Met的殘基Met1160和Ile1084取向與吡唑環(huán)鄰近，不利于氨基吡啶的氫鍵結合，而且該吡唑環(huán)處于酶蛋白的疏水性界面，為了發(fā)生疏水-疏水相互作用，N原子的孤電子對的去水合作用是不利的焓變；而13的N原子都進入了水相，沒有上述的不利效應，因而活性高12，酶或細胞活性提高了30～40倍?；衔?3的N-甲基化后產(chǎn)14的活性更強，提示由這個N原子可引出含有極性基團的碳鏈，以提高活性水溶性。

       N-取代的吡唑化合物的優(yōu)化

       鑒于化合物9結構中含有延伸到水相的堿性基團能夠提高活性和親脂性效率，因而也在吡咯環(huán)系上引入盡可能小的堿性片段,例如鏈烷基，胺、氮雜環(huán)丁烷、四氫吡咯、哌 啶等，以增加活性和改善藥學和藥代性質。在選擇高活性和高親脂性效率的化合物同時，還評價對人肝微粒體的穩(wěn)定性，從有代表性的化合物中優(yōu)選出15和16，尤其是因16的高活性和較好的代謝穩(wěn)定性，確定為候選藥物。

       克里唑替尼的成功

       前述優(yōu)化過程制備的吡唑系列化合物含有手性碳原子，都是用混旋的樣品測定活性的。將優(yōu)選出的化合物16拆分成光學活性物質，活性測定表明，R-構型的分17活性強于RS和S構型，對酶和細胞抑制活性分別為Ki = 0.002μmol·L-1和IC50=0.008μmol·L-1，命名為克里唑替尼(crizotinib)。

       克里唑替尼從2007年立項到2011年FDA批準上市，僅用了4年時間，它的出現(xiàn)是個體化治療的又一重大突破，其在臨床上的地位超越了常規(guī)化療，是當前ALK 陽性的晚期非小細胞肺癌患者標準藥物。

       參考文獻

       1 Cui JR, et al. 4-Aryl substituted indolinones. WO02/055517

       2 Cui JR, et al. 5-Aralkylsulfonyl-3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinones as kinaseinhibitors. WO 02/096361

       3 Cui JR, Tran DM, Shen H, et al. Structurebased drug design of crizotinib (PF-02341066), a potent and selective dualinhibitor of mesenchymal-epithelial transition factor (c-MET) kinase andanaplastic lymphoma kinase (ALK). J Med Chem, 2011, 54: 6342-6363

       4 Roberts PJ. Clinical use of crizotinib for thetreatment of non-small cell lung cancer. Biologics, 2013, 7: 91–101.