抗體類生物治療藥物因其具有靶向性強(qiáng)、特異性好、治療效果顯著等優(yōu)點(diǎn)，在生物藥中占據(jù)越來越重要的地位。近年來，抗體藥物獲批數(shù)量顯著增加，市場占有率節(jié)節(jié)攀升，成為生物藥中增長最快的領(lǐng)域。隨著抗體藥物的需求不斷加大，抗體技術(shù)的發(fā)展也日新月異，從多克隆抗體制備到單克隆抗體篩選，取得了鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體到全人源抗體等一系列突破性的成果，抗體技術(shù)成為生物技術(shù)領(lǐng)域特別是生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

       根據(jù)發(fā)展歷程，抗體技術(shù)可分為多克隆抗體技術(shù)、雜交瘤單克隆抗體技術(shù)和基因工程抗體技術(shù)3個(gè)階段。多克隆抗體的制備多通過免疫動(dòng)物獲得，當(dāng)抗原注射到動(dòng)物體內(nèi)后就會(huì)產(chǎn)生針對該抗原的抗體。大多數(shù)抗原表面成分復(fù)雜，具有多種不同的抗原表位，因而免疫血清中產(chǎn)生的抗體為針對多種抗原成分或抗原表位的、綜合的、不均一的多克隆抗體。目前，恢復(fù)期患者血漿療法用于急性病**傳染病的應(yīng)急治療仍受到廣泛關(guān)注，如在流感、埃博拉、嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）及新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）流行期間均使用患者恢復(fù)期血漿療法進(jìn)行治療或臨床研究。雜交瘤單克隆抗體技術(shù)是將能夠產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞和能夠無限繁殖的腫瘤細(xì)胞融合，融合后的子代細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又能夠無限傳代，從而獲得抗體純度高、理化性質(zhì)均一、特異性強(qiáng)的單克隆抗體。基因工程抗體技術(shù)是利用重組DNA和蛋白質(zhì)工程技術(shù)等對編碼抗體的基因按不同需要進(jìn)行加工改造和重新裝配，經(jīng)轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞所表達(dá)的抗體分子。利用基因工程抗體技術(shù)減少抗體鼠源成分，增加人源化程度，降低免疫原性，成為第三代抗體技術(shù)。目前常見的技術(shù)包括鼠源抗體人源化技術(shù)，以及抗體文庫展示技術(shù)、轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)和單細(xì)胞測序技術(shù)等人源抗體篩選技術(shù)。

       隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，結(jié)合抗體藥物的生物學(xué)特性，研發(fā)人員在傳統(tǒng)抗體技術(shù)的基礎(chǔ)上不斷優(yōu)化創(chuàng)新，力求通過更簡便快速的方法，獲得免疫原性更低、人體相容性更好及成本更低的治療性抗體。

       1、雜交瘤單克隆抗體技術(shù)

       雜交瘤單克隆抗體技術(shù)是將免疫動(dòng)物的 B 淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成在體外長期存活并能分泌免疫球蛋白的雜交瘤細(xì)胞，通過克隆化得到來自單個(gè)雜交瘤細(xì)胞的雜交瘤單克隆細(xì)胞系，生產(chǎn)大量單克隆抗體。此過程中，雜交瘤細(xì)胞 2 次篩選至關(guān)重要。最傳統(tǒng)的二次雜交瘤篩選方法為有限稀釋法。該方法操作簡單，不需要特殊設(shè)備，但人工操作速度慢、效率低、耗時(shí)長、易出錯(cuò)，不能滿足高通量篩選的要求。流式分選技術(shù)也較多用于雜交瘤細(xì)胞的篩選，該方法具有自動(dòng)化速度快和精確度較高等優(yōu)點(diǎn)，但需要對細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，且檢測結(jié)果易受細(xì)胞周期影響。全自動(dòng)細(xì)胞篩選系統(tǒng)（Cellcelector）是一種當(dāng)前廣泛應(yīng)用的雜交瘤篩選技術(shù)，該技術(shù)具有高通量，自動(dòng)化，高效率，可編程、量化和存檔及追溯等優(yōu)點(diǎn)，可縮短研發(fā)周期，降低成本。

       雜交瘤單克隆抗體技術(shù)方便、簡單、成本低，但僅能用于鼠源抗體篩選。1986年，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)上市的第一個(gè)用雜交瘤技術(shù)篩選的鼠源抗體藥物莫羅單抗（muromomab-CD3）。鼠源抗體能夠被人體免疫系統(tǒng)識(shí)別，引起強(qiáng)烈的人抗鼠抗體反應(yīng)，使得藥物療效減弱，并引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)。為解決這一問題，科學(xué)家利用基因工程方法對鼠源抗體進(jìn)行人源化，在一定程度上減弱了人抗鼠抗體反應(yīng)。直至 1994 年，美國FDA 才批準(zhǔn)了第二個(gè)抗體藥物即人鼠嵌合抗體藥物阿昔單抗（abciximab）上市。此后，通過雜交瘤技術(shù)篩選得到抗體通常需要進(jìn)一步進(jìn)行人源化改造，才能作為抗體藥物進(jìn)入臨床應(yīng)用。

       2、抗體文庫展示技術(shù)

       抗體文庫展示技術(shù)是近 30 多年快速發(fā)展起來的一項(xiàng)技術(shù)，主要用來篩選人源抗體。利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）從 B 細(xì)胞中擴(kuò)增出抗體的重鏈和輕鏈群，將它們連入合適的載體表達(dá)隨機(jī)的聯(lián)合抗體文庫。按抗體基因來源，目前抗體庫主要有天然抗體庫、半合成抗體庫、全合成抗體庫和混合抗體庫等類型。同時(shí)，隨著計(jì)算機(jī)輔助分析和虛擬設(shè)計(jì)的發(fā)展，還發(fā)展出表位特異性的靶向抗體庫技術(shù)平臺(tái)。根據(jù)抗體文庫所用載體的不同，目前主要的技術(shù)有噬菌體展示技術(shù)、酵母表面展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)和mRNA展示技術(shù)等。

       噬菌體展示技術(shù)的基礎(chǔ)為噬菌體侵蝕細(xì)菌并利用細(xì)菌表達(dá)自身外殼蛋白等過程。2002 年，美國 FDA 批準(zhǔn)上市的首 個(gè)全人源抗體藥物阿達(dá)木單抗（adalimumab）就是利用噬菌體展示文庫篩選得到的。此外，具有結(jié)構(gòu)簡單、相對分子質(zhì)量小、穩(wěn)定性強(qiáng)、易于重組改造、組織穿透力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)的納米抗體，也通常是利用免疫羊駝聯(lián)合噬菌體展示文庫技術(shù)篩選而來，如2018年9月美國 FDA 批準(zhǔn)上市的納米抗體藥物-卡普賽珠單抗（caplacizumab）。

       酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)是一項(xiàng)真核蛋白展示技術(shù)。作為真核表達(dá)系統(tǒng)，酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)可以對蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，且真核分泌系統(tǒng)有"質(zhì)量"控制機(jī)制，能阻止錯(cuò)誤折疊的蛋白被輸運(yùn)出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。此外，可使用流式細(xì)胞術(shù)對已構(gòu)建的酵母細(xì)胞庫進(jìn)行定量和實(shí)時(shí)篩選，高效便捷。2020年，美國FDA批準(zhǔn)在巴斯德畢赤酵母細(xì)胞表達(dá)得到的抗體藥物依普奈珠單抗（eptinezumab）上市，使其成為首 個(gè)酵母表達(dá)的抗體藥物。目前該技術(shù)也被用于納米抗體的開發(fā)。

       核糖體展示技術(shù)和mRNA展示技術(shù)作為新興的克隆展示技術(shù)，完全在體外進(jìn)行。通過構(gòu)建 DNA 文庫，在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄與翻譯，最終形成"mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)"（核糖體展示技術(shù)）或"cDNAmRNA-蛋白質(zhì)"（mRNA 展示技術(shù)）三聚體，使目的蛋白的基因型（mRNA）和表型（蛋白質(zhì)）聯(lián)系起來，最后從中分離 mRNA 或 cDNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄 PCR（RT-PCR）擴(kuò)增。該類技術(shù)與噬菌體或酵母細(xì)胞展示技術(shù)相比，具有建庫簡單、庫容量大、分子多樣性強(qiáng)、篩選方法簡便、可通過引入突變和重組技術(shù)提高靶標(biāo)蛋白親和力等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，mRNA展示技術(shù)經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的 cDNA/mRNA 雜交雙鏈，還避免了RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)對體外篩選的干擾。目前，越來越多的研究人員將該類技術(shù)應(yīng)用于新藥開發(fā)領(lǐng)域。

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       參考資料

       [1]武瑞君,桑曉冬,李治非,敖翼,范玲.抗體技術(shù)的研發(fā)現(xiàn)狀與展望[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2021,35(05):374-381.

       [2]馮健男,喬春霞.人源治療性抗體研發(fā)技術(shù)進(jìn)展[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2020,40(11):1571-1574.

       作者簡介：小米蟲，藥品質(zhì)量研究工作者，長期致力于藥品質(zhì)量研究及藥品分析方法驗(yàn)證工作，現(xiàn)就職于國內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事藥品檢驗(yàn)分析及分析方法驗(yàn)證。