前蛋白轉(zhuǎn)換酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)是一種由肝 臟合成分泌的絲氨酸蛋白酶，可以與低密度脂蛋白受體(LDLR)結(jié)合，從而在細胞內(nèi)吞時將其運輸?shù)饺苊阁w，并促進細胞內(nèi)降解以防止其再循環(huán)。然而，如果循環(huán)過程中低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平異常升高，將會容易引發(fā)動脈粥樣硬化性的心血管疾病(ASCVD)。因此，將PCSK9作為治療靶點，設(shè)計出調(diào)節(jié)血漿LDL-C水平以預(yù)防ASCVD的新藥是目前一種新興的治療方法之一。

       本文主要重點介紹了基于多肽的PCSK9抑制劑的結(jié)構(gòu)特點和設(shè)計、對患者的治療作用、以及PCSK9的調(diào)節(jié)機制，以及抗PCSK9肽作為一種有希望替代單克隆抗體（MABs）來調(diào)節(jié)LDL-C水平的藥物，正在成為一種有前途的新一代治療方法。

       背景介紹

       患上動脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)的患者估計每年在護理、藥物和生產(chǎn)力損失方面的成本可能就要超過2000億美元，同時它也是美國的頭號死亡原因。高脂血癥是ASCVD的一個公認的風(fēng)險因素，包括動脈粥樣硬化、中風(fēng)、心力衰竭、心肌梗死(MI)和冠心病(CHD)。

       與健康人相比，高膽固醇[低密度脂蛋白膽甾醇（LDL-C）升高]的人患心臟病的風(fēng)險增加2倍。美國高LDL-C成年人的人數(shù)為7370萬，即31.7%。在接受治療（他汀單獨或聯(lián)合依折麥布）的約48.1%的高LDL-C患者中，只有29.5%的受試者病情得到控制。家族性高膽固醇血癥(FH)是導(dǎo)致LDL-C終身升高和冠心病風(fēng)險顯著增高的常見形式。

       前蛋白轉(zhuǎn)換酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型（proprotein convertase subtilisin/kexin-type 9，PCSK9)被發(fā)現(xiàn)為FH的遺傳決定因素，近年來成為降低高膽固醇血癥患者LDL-C水平的潛在靶點。PCSK9通過降解低密度脂蛋白受體(LDLR)來調(diào)節(jié)血清中LDL-C水平。因此，PCSK9抑制劑已成為一種血脂控制新療法，可減輕動脈粥樣硬化的發(fā)病機制，降低心血管事件和死亡率。

       PCSK9在血管壁、腸、腎和腦中表達，在這些組織中，除了提高脂質(zhì)外，它還參與了其它的功能，盡管有新的證據(jù)表明PCSK9可以發(fā)揮多種多效性作用，但它的主要功能仍然是控制膽固醇的穩(wěn)態(tài)。（圖1）

       圖1. PCSK9發(fā)揮多效性效應(yīng)的示意圖。

       高膽固醇血癥的治療

       許多降脂療法已顯示出治療高脂血癥的積極結(jié)果。其中以羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMG-CoAR）抑制劑（他汀類藥物）、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白抑制劑（anacetrapib）、膽固醇吸收抑制劑（依折麥布）、和PCSK9抑制劑等為代表。

       如果飲食和生活方式的改善未能降低LDL-C水平，通常通過他汀類藥物作為一線藥物治療。然而，他汀類藥物治療與不良副作用相關(guān)，包括他汀類藥物相關(guān)肌肉癥狀、肝毒 性、發(fā)生2型糖尿病的可能性和出血性卒中風(fēng)險。此外，約50%使用他汀類藥物的個體無法將其LDL-C水平降低至預(yù)期水平，從而使患者發(fā)生腦血管疾病的風(fēng)險升高。

       此外，他汀類藥物治療可上調(diào)PCSK9，進一步降低他汀類藥物的有效性。依折麥布是降低LDL-C的二線藥物，可阻止腸道吸收膽固醇。對于接受最高劑量他汀類藥物治療但仍需要額外降低LDL-C的個體或他汀類藥物不耐受的患者，則需要依折麥布作為輔助治療。在LDL-C和FH水平最高的個體中，高強度他汀類藥物單藥治療或與依折麥布聯(lián)合治療不足以達到預(yù)期的LDL-C水平。

       而PCSK9抑制劑比他汀類藥物的優(yōu)勢是，他汀類藥物不會顯著降低脂蛋白(a) [LP(a)]水平，這是腦血管疾病（CVD）的一個獨立危險因素，而PCSK9抑制劑則會降低。這是因為PCSK9參與LDL相關(guān)蛋白-1的降解，該蛋白分解LP(a)，因此，抑制PCSK9會提高LDL相關(guān)蛋白-1的水平，從而增加LP(a)的分解。在表1中對比了他汀類藥物和PSCK9抑制劑的臨床治療影響。

       表1. 高強度他汀類藥物和PCSK9抑制劑對臨床血漿參數(shù)影響的觀察

       PCSK9

       3.1 PCSK9的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能

       PCSK9是絲氨酸蛋白酶家族的第九個也是最后一個成員，該家族包括原蛋白轉(zhuǎn)化酶1(PC1)，PC2，PC4，PC5，PC7，F(xiàn)urin,配對堿性氨基酸裂解酶4(PACE4)，枯草桿菌蛋白酶Kexin同工酶1和PCSK9.這個絲氨酸蛋白酶家族更類似于細菌枯草桿菌蛋白酶。前八個轉(zhuǎn)化酶(PC1到SKI-1)裂解分泌性蛋白前體以產(chǎn)生調(diào)節(jié)發(fā)育和代謝的生物活性肽、多肽和激素。

       然而，PCSK9自身裂解，不再作為蛋白酶發(fā)揮作用。相反，它起非酶作用，并增強LDLR的內(nèi)體和溶酶體降解（在LDL-C穩(wěn)態(tài)中至關(guān)重要）。人PCSK9(hPCSK9)基因編碼72kDa的酶原，含692個氨基酸，由12個外顯子和11個內(nèi)含子組成。11個PCSK9具有信號肽、原結(jié)構(gòu)域、與枯草桿菌蛋白酶相似的催化結(jié)構(gòu)域(CD)和絲氨酸蛋白酶中具有獨特折疊的可變C端結(jié)構(gòu)域。

       PCSK9蛋白的晶體結(jié)構(gòu)如圖2A(PDB:2PMW)所示。控制PCSK9細胞定位的基序可能存在于羧基末端結(jié)構(gòu)域（殘基452至692）中，其特征是富含半胱氨酸和組氨酸的區(qū)域(CHRD)。該結(jié)構(gòu)域與抵抗素同型三聚體具有結(jié)構(gòu)相似性，抵抗素同型三聚體是一種與糖尿病和肥胖有關(guān)的微小細胞因子，對PCSK9-LDLR復(fù)合體的內(nèi)溶酶體降解至關(guān)重要。產(chǎn)生的PropCSK9在VFAQ152SIP位點經(jīng)歷了自催化裂解，形成了一個13 kDa的前結(jié)構(gòu)域和一個成熟的PCSK9結(jié)構(gòu)域（圖2B），為了使PCSK9在生物學(xué)上運作，需要原結(jié)構(gòu)域和PCSK9的異源二聚體，但不需要PCSK9的酶活性為了防止催化三聯(lián)體排列和保護鄰近的蛋白質(zhì)免受其絲氨酸蛋白酶活性的影響，PCSK9的蛋白酶活性被抑制。成熟的PCSK9在肝細胞外以一種完整的異源二聚體(62+13kDa)的形式分泌。PCSK9已被證明在控制膽固醇穩(wěn)態(tài)方面具有重要功能。

       PCSK9最顯著的特征是它與LDLR的EGF-A結(jié)構(gòu)域相互作用，并通過將其引導(dǎo)到溶酶體來促進受體降解。PCSK9:EGF-A復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)如（圖2C）所示(PDB:3bps)。值得注意的是，與PCSK9的起源無關(guān)，LDLR調(diào)節(jié)其從等離子體中的清除。LDLR當附著在LDL-C上時，進入細胞，然后在內(nèi)體中與LDL-C解離，如果不與PCSK9偶聯(lián)，最終會穿梭到細胞表面。

       圖2. (A) PCSK9蛋白的晶體結(jié)構(gòu)顯示了多種結(jié)構(gòu)域，包括原結(jié)構(gòu)域（綠色）、C端結(jié)構(gòu)域（棕色）和類似枯草桿菌蛋白酶的催化結(jié)構(gòu)域（PDB:2PMW)。(B) PCSK9在肝細胞中成熟過程示意圖。(C) PCSK9:EGF-A復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)表明了EGF-A結(jié)構(gòu)域的fldlr(藍色)和PCSK9的不同結(jié)構(gòu)域(PDB: 3BPS)。

       3.2 PCSK9在動脈粥樣硬化形成中的作用

       動脈粥樣硬化斑塊是一種脂蛋白驅(qū)動的疾病，其特征是動脈壁內(nèi)膜增生、炎癥、壞死和鈣化。肝、腎和小腸是循環(huán)PCSK9的主要來源。PCSK9也由內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞(VSMC)合成，并在較小程度上由巨噬細胞合成。這些觀察表明，用PCSK9刺激的巨噬細胞可能抑制泡沫細胞的形成，從而形成動脈粥樣硬化。結(jié)合這些發(fā)現(xiàn)將PCSK9與斑塊的形成聯(lián)系起來。隨著巨噬細胞從單核細胞（幾乎無法檢測到）到分化單核細胞（在那里高表達）再到完全分化的巨噬細胞，PCSK9基因在巨噬細胞中的表達逐漸增加。有趣的是，用Evolocumab抑制PCSK9改善了HIV+血脂異?；颊叩墓跔顒用}內(nèi)皮功能。當HPCSK9通過增強骨髓來源的LY6ChIgH單核細胞的病變浸潤而改變斑塊結(jié)構(gòu)，進而導(dǎo)致它們以LDLR依賴的方式分化為巨噬細胞時，PCSK9可能促進動脈粥樣硬化形成中的炎癥的想法首次被實現(xiàn)。

       這些結(jié)果與HPCSK9表達增加脂多糖刺激的小鼠腹腔巨噬細胞腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)mRNA表達的事實一致，這一事實后來在原代人巨噬細胞中得到證實。

       PCSK9的缺失導(dǎo)致了一種通過LDLR以外的途徑易感動脈粥樣硬化的小鼠品系中致動脈粥樣硬化脂蛋白較少的表型。LDLR、APOBEC1和PCSK9缺失小鼠的脂蛋白暴露于內(nèi)皮細胞后，內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的ICAM-1、IL-1β和趨化因子（包括CCL2和CCL-7）減少，所有這些都促進了單核細胞向血管壁的粘附和浸潤。在參與動脈粥樣硬化炎癥負擔的眾多炎癥因子和清道夫受體中，凝集素氧化脂蛋白-1(LOX1)起主導(dǎo)作用。

       LOX-1與PCSK9呈正相關(guān)，LOX-1促進PCSK9，PCSK9促進LOX-1和氧化LDL的吸收。此外，小鼠重組PCSK9可促進TNF-α誘導(dǎo)的巨噬細胞中清除受體（如CD36和LOX-1)的表達和氧化LDL的吸收。LDLR相關(guān)家族，如LRP5，也有助于脂質(zhì)內(nèi)化到巨噬細胞中。盡管PCSK9和LRP5不會改變彼此的表達，但它們在核周區(qū)域的共定位允許它們直接相互作用。免疫沉淀研究表明，聚集的LDL刺激促進脂質(zhì)負載巨噬細胞的形成。

       如前所述，樹突狀細胞或巨噬細胞中脂蛋白產(chǎn)生的脂質(zhì)的積累激活了一種稱為炎癥體的多蛋白復(fù)合物。人類動脈粥樣硬化病變具有三個結(jié)構(gòu)域的增加表達，這三個結(jié)構(gòu)域組成核苷酸寡聚結(jié)構(gòu)域(NOD)、富含亮氨酸重復(fù)(LRR)和NLR家族含pyrin結(jié)構(gòu)域(NLRP3)炎癥體：末端pyrin結(jié)構(gòu)域、中央核苷酸結(jié)構(gòu)域（NACHT結(jié)構(gòu)域）和C末端富含賴氨酸結(jié)構(gòu)域。NLRP3復(fù)合物的形成導(dǎo)致自催化Caspase 1激活。在炎癥和PCSK9之間的糾纏相互作用中，γ干擾素促進mRNA表達，而NLRP3途徑調(diào)節(jié)PCSK9分泌。在不產(chǎn)生LDLR基因敲除的情況下，研究轉(zhuǎn)基因或敲除小鼠的動脈粥樣硬化發(fā)病機制的體內(nèi)實驗進一步支持了PCSK9在動脈粥樣硬化過程中的關(guān)鍵參與。

       3.3抗PCSK9的藥物類型

       PCSK9抑制劑是利用針對PCSK9生產(chǎn)、加工和結(jié)合的策略開發(fā)的，以控制循環(huán)LDL-C水平（圖3）。開發(fā)小分子的常規(guī)方法尚未對 PCSK9 有效。這同樣適用于開發(fā)基于蛋白質(zhì)的疫苗接種，這些疫苗可引導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗 PCSK9 抗體以中和循環(huán)中的 PCSK9。然而這些疫苗也未達到標準預(yù)期。因此，探索 CRISPR-Cas9、小干擾核糖核酸 (siRNA)、反義寡核苷酸 (ASO)、單克隆抗體、adnectin、anticalin 和肽等新藥模式的研究勢頭強勁。

       圖3. 針對 PCSK9 生產(chǎn)、加工和與 LDRL 結(jié)合以管理 LDL-C 水平的各種藥物類型。

       3.3.1抗PCSK9的小分子治療

       使用小分子靶向PCSK9有幾個優(yōu)點，包括更好的穩(wěn)定性、更低的生產(chǎn)成本和更簡單的管理（表2，條目1）。這些小分子通過阻斷PCSK9:LDLR PPIs,干擾PCSK9的成熟和分泌，或抑制PCSK9的表達來降低LDL-C。然而，小分子（質(zhì)量500 DA）不能有效抑制PCSK9:EGF-a PPIs，因為PCSK9的表面相對平坦、無特征且不可成藥。上述假說從小分子介導(dǎo)的PCSK9抑制只產(chǎn)生一個足夠感興趣的潛在候選藥物，即CVI-LM001(1)這一事實中得到了明顯的證明。CVI-LM001(1)是紫堇堿的氟苯磺酸衍生物，通過抑制PCSK9基因的表達而起作用（圖4）。在IB期研究(CTR20160744)中，300毫克劑量的CVI-LM001(1)使LDL-C水平升高的參與者的LDL-C水平降低26.3%，TC降低20.1%，載脂蛋白降低17.4%。

       圖4. 臨床小分子抗 PCSK9 療法 1 和 2 的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

       表2. PCSK9抑制藥物類型的比較

       3.3.2 Adnectin 作為 PCSK9 靶向治療藥物

       Adnectin是為延長給藥間隔而開發(fā)的新模式。Adnectins是重組融合蛋白，與MABs相比具有許多優(yōu)點，如體積小、費用低、生產(chǎn)容易、親和力高、起效快（表2,條目7）。在I期臨床研究中，BMS-962476是一種與聚乙烯偶聯(lián)的多肽，使LDL-C水平下降48%，使游離PCSK9下降>90%(NCT01587365)。PCSK9和Adnectin的X射線共晶結(jié)構(gòu)很好的揭示了對PCSK9的抑制機制（BMS-962476的祖細胞）。共晶的每個晶胞包含兩個PCSK9-腎上腺素復(fù)合物，如圖6A(PDB ID:4OV6)所示。LDLR與PCSK9-Adnectin結(jié)構(gòu)的重疊表明Adnectin 1459D05位于LDL受體結(jié)合表面附近，以阻止PCSK9:LDLR PPIs發(fā)揮作用（圖5B)。

       圖5. (A)PCSK9與Adnectin 1459D05的共晶結(jié)構(gòu)顯示一個包含兩個PCSK9-Adnectin復(fù)合物的晶胞（PDB ID:4OV6)。（B）LDLR（綠色）與PCSK9/Adnectin結(jié)構(gòu)的重疊，表明LDLR與Adnectin之間的空間沖突(PDB ID:3P5C)。

       3.3.3 作為PCSK9靶向治療藥物的多肽

       與其他抑制PCSK9的策略相比，多肽有幾個好處（表2，條目9）。例如，小分子由于體積小而缺乏選擇性，不能有效地與PCSK9等不可藥物作用的靶點結(jié)合。類似地，大型生物制劑，如MABS，價格昂貴，不穩(wěn)定，缺乏藥物性質(zhì)。相反，多肽治療有一個理想的大小(500-5000Da)，這使得很容易使它們功能化以增強它們的藥物樣特征，如生物利用度、穩(wěn)定性、親和力和特異性。進一步多肽模擬復(fù)雜蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而允許它們與PCSK9相對平坦和大的表面相互作用以破壞PCSK9:LDLR PPIs。

       此外，多肽治療藥物，像小分子藥物一樣，比大型生物藥物更容易制造，這降低了生產(chǎn)成本。因此，多肽在許多方面占據(jù)了小分子和生物藥物之間的獨特位置，并被認為是可能干擾PCSK9功能的重要藥物先導(dǎo)物（圖6）。

       圖6. 使用 BioRender.com 創(chuàng)建的大型生物和小分子療法與肽模式的比較。

       基于PCSK9多肽抑制劑的臨床研究

       兩種肽 PCSK9 抑制劑 MK-0616 (5) 和 NNC03850434 (NN6434, 6) 已進入臨床試驗階段。大環(huán)肽以其對蛋白水解降解的高穩(wěn)定性而聞名，并具有破壞大而扁平目標的 PPI 的固有特性?？紤]到 PCSK9 的 PPI 與 LDLR 的相似特征，LDLR 是一種環(huán)肽抑制劑PCSK9(3)利用mRNA展示技術(shù)被設(shè)計（圖7）。然后將HIT肽3優(yōu)化為一種高效的、代謝穩(wěn)定的PCSK9抑制劑，其分子量降低為4。然后將第二代肽4精制成三環(huán)的、口服生物可用的MK-0616(5)。MK-0616(5)是一種新型大環(huán)化合物，其親水性、抑菌能力（約10萬×)和體內(nèi)活性均優(yōu)于初始先導(dǎo)化合物。在I期臨床研究中，單劑量10-300毫克的MK-0616(5)耐受性良好，并使健康參與者血清中PCSK9水平下降90%。

       另一種治療高膽固醇血癥的基于肽的長效PCSK9抑制劑是諾和諾德的NN6434(6)。目前正在對NN6434進行多次第一和第二階段臨床研究。2022年，啟動了一項I期試驗，以測試三種不同的NN6434(6)片劑配方來治療高膽固醇血癥(NCT05333107)。在II期臨床試驗中，他們還計劃評估15毫克NN6434(6)對CVD患者的有效性(NCT04992065)。

       圖7. (A)Merck大環(huán)MK-0616(5)的設(shè)計和生物活性。(B)與PCSK9上LDLR結(jié)合位點結(jié)合的4的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:6XIE)。

       總結(jié)與展望

       長期以來由于PCSK9的表面相對平坦且無特征，因此開發(fā)能夠阻止PCSK9與LDLR相互作用的小分子非常具有挑戰(zhàn)性。幸運的是，多肽作為一種特殊的化學(xué)類型，為大生物制劑和小分子提供了一種有希望的替代方案，并成為抑制PCSK9的有吸引力的下一代治療藥物。

       為了提高PCSK9抑制劑的剛性、蛋白水解穩(wěn)定性、細胞通透性和口服生物利用度，許多制藥行業(yè)都在廣泛地研究肽的環(huán)化。例如，最 先進和最有效的抗PCSK9肽是大環(huán)，如諾華的13PCSK9I和默克的MK-0616。制藥行業(yè)對開發(fā)大環(huán)肽作為PCSK9拮抗劑的興趣和投入加大，進一步加強了這種方法治療高膽固醇血癥的治療前景。因此，我們非常期待發(fā)展更多安全有效的PCSK9抑制劑來造?；颊摺?/p>

       參考文獻

       [1] Heart Disease and Cancer Deaths-Trends and Projections in the United States,

       1969?2020. Prev. Chronic Dis. 2016, 13, 160211.

       [2] With Special Emphasis on Its Effect beyond LDL-Cholesterol Lowering. J. Lipids 2018, 2018, 1?13.

       [3] PCSK9 Biology and Its Role in Atherothrombosis. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22

       (11), 5880.

       [4] Exploring Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin 9 (PCSK9) Autoproteolysis Process by Molecular Simulations: Hints for Drug Design. ChemMedChem. 2020, 15 (16), 1601?1607.

       [5] Recent Update on the Development of PCSK9 Inhibitors for Hypercholesterolemia Treatment.[J] .J Med Chem, 2022, 65: 15513-15539.