靶向蛋白降解(Targeted protein degradation, TPD)作為一種新興的治療策略被廣泛關(guān)注，它可以靶向以前被認(rèn)為“不可成藥”的蛋白質(zhì)。PROTAC是TPD的主要焦點(diǎn)，它同時(shí)招募并結(jié)合E3連接酶和靶蛋白(POI)，從而形成E3-降解蛋白POI三元復(fù)合物，誘導(dǎo)POI泛素化和隨后的蛋白體降解。

       鑒于PROTAC巨大的治療潛力和獨(dú)特的機(jī)制，該領(lǐng)域引起了學(xué)術(shù)界和制藥行業(yè)的極大興趣，目前已有250種藥物被PROTACs進(jìn)行降解測(cè)試。盡管PROTAC具有廣泛的治療潛力，但在人類基因組的數(shù)百種E3連接酶中，目前只有不到2%的E3連接酶參與了TPD領(lǐng)域的研究，因此，需要招募更多的E3連接酶來進(jìn)一步增強(qiáng)TPD的治療潛力。

       近日，美國(guó)國(guó)家癌癥中心的Eytan Ruppin教授和印第安納大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物統(tǒng)計(jì)與健康數(shù)據(jù)科學(xué)系Leng Han教授團(tuán)隊(duì)研究人員對(duì)1075個(gè)E3連接酶進(jìn)行了表征，最終確定了76種有潛力的E3連接酶，擴(kuò)展了PROTAC的E3連接酶版圖，推動(dòng)了PROTACs藥物的開發(fā)進(jìn)展。

       研究人員收集了E3連接酶的綜合列表(圖1a)，并利用大規(guī)模數(shù)據(jù)資源、實(shí)驗(yàn)證據(jù)和人工智能(AI)工具來描繪E3連接酶的七個(gè)不同的關(guān)鍵維度：

       化學(xué)配位性，表征E3連接酶的粘合劑可用性;

       E3連接酶在腫瘤和正常樣本中單細(xì)胞水平和整體水平的表達(dá)模式;

       進(jìn)一步表征其潛在蛋白靶點(diǎn)的E3連接酶的PPI;

       在PROTAC設(shè)計(jì)中應(yīng)優(yōu)先考慮的其他重要因素，包括結(jié)構(gòu)可用性、功能必要性、細(xì)胞定位和E3連接酶的PPI接口(圖1b)。

       之后，他們基于三十個(gè)大規(guī)模數(shù)據(jù)集分析，包括3個(gè)E3連接酶列表、5個(gè)配體庫(kù)、5個(gè)表達(dá)圖譜、7個(gè)互作數(shù)據(jù)庫(kù)、2個(gè)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)、2個(gè)重要性篩選、3個(gè)細(xì)胞定位數(shù)據(jù)庫(kù)和3種互作界面數(shù)據(jù)庫(kù)，研究人員揭示了幾種有前途的現(xiàn)存的E3連接酶。

       PART.

       01

       化學(xué)配位性

       表征E3連接酶的粘合劑可用性

       為了尋找可能促進(jìn)E3連接酶募集的新的藥物，研究人員采用基于深度學(xué)習(xí)的虛擬篩選配體模型HyperAttentionDTI31，在DrugBank25中搜索E3連接酶與藥物之間潛在的相互作用。

       在評(píng)估和應(yīng)用該模型后，研究人員獲得了預(yù)測(cè)的藥物-靶標(biāo)相互作用，包括潛在的新型E3連接酶，如Makorin Ring Finger Protein 1 (MKRN1)，與關(guān)鍵腫瘤驅(qū)動(dòng)因子TP53和APC32具有ppi，并預(yù)測(cè)與DB13955(雌 二醇二酸酯)和DB03017(月桂酸)相互作用。利用這些藥物可能會(huì)增加潛在的新型E3連接酶的配體性，從而靶向其他腫瘤靶點(diǎn)。他們系統(tǒng)分析利用了五個(gè)大規(guī)模的數(shù)據(jù)源，并揭示了許多新的E3連接酶和數(shù)十種可用的配體，這些配體可能用于PROTAC的開發(fā)。

       PART.

       02

       E3連接酶在腫瘤和正常樣本中

       單細(xì)胞及整體水平的表達(dá)模式

       通過對(duì)腫瘤和正常組織的整合分析，研究人員確定了206個(gè)E3連接酶，包括3個(gè)增選的和203個(gè)新的E3連接酶，它們?cè)赥CGA和HPA病理中至少一種腫瘤類型中高表達(dá)，而在GTEx和Tabula及大多數(shù)正常組織中低表達(dá)。除了這3種被采用的E3連接酶，這203種潛在的新型E3連接酶揭示了一個(gè)大型的E3連接酶庫(kù)，可用于抗癌PROTAC的開發(fā)。

       研究人員全面描繪了大細(xì)胞水平和單細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)，以及E3連接酶的蛋白質(zhì)組表達(dá)，證明了利用大規(guī)模表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)一步推進(jìn)PROTAC提高療效和規(guī)避副作用的必要性。

       PART.

       03

       E3連接酶與POI蛋白

       相互作用(PPI)的綜合圖譜

       蛋白質(zhì)被PROTAC降解的可能性因靶蛋白而異，總結(jié)E3連接酶相關(guān)的ppi應(yīng)優(yōu)先考慮能被PROTAC高降解的靶蛋白。為了確定這些PROTAC靶點(diǎn)，研究人員將PROTACtable基因組和基于模型的蛋白質(zhì)降解性分析(MAPD)兩項(xiàng)研究的結(jié)果結(jié)合起來，對(duì)靶點(diǎn)的PROTACtable可降解性進(jìn)行了評(píng)估。這兩項(xiàng)研究突出了3280個(gè)PROTAC可處理靶點(diǎn)，其中1025個(gè)靶點(diǎn)重疊。

       研究人員還發(fā)現(xiàn)了一些PPIs涉及PROTAC可治療的癌癥靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)尚未在PROTAC中被探索。例如，神經(jīng)母細(xì)胞瘤RAS(NRAS)與轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的不良預(yù)后相關(guān)，有證據(jù)表明PPIs具有增選的E3連接酶BIRC2和XIAP，以及潛在的新型E3連接酶CDC20和SKP2。另一個(gè)PROTAC可處理的靶點(diǎn)是Rac Family Small GTPase 1 (RAC1)，它誘導(dǎo)乳腺癌的化療耐藥，與增選的E3連接酶MDM2和XIAP以及潛在的新型E3連接酶ITCH和SMURF2相互作用。在開發(fā)針對(duì)這些癌癥靶點(diǎn)的PROTACs時(shí)，可以考慮相應(yīng)的E3連接酶。

       PART.

       04

       E3連接酶的結(jié)構(gòu)可用性、

       功能必要性、細(xì)胞位置和PPI接口

       首先，為了獲得E3連接酶的可用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，研究人員查詢了世界范圍內(nèi)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)protein Data Bank (PDB)，鑒定出414個(gè)具有實(shí)驗(yàn)確定結(jié)構(gòu)的E3連接酶。這些可用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，為招募潛在的新E3連接酶提供了很好的機(jī)會(huì)。

       然后，研究人員利用依賴圖譜(DepMap)61中的CRISPR和RNAi技術(shù)，研究了E3連接酶的遺傳擾動(dòng)，評(píng)估了癌細(xì)胞系中基因的必要性。他們?cè)贑RISPR篩選中鑒定出146個(gè)腫瘤必需的E3連接酶，包括兩個(gè)增選的E3連接酶——VHL和RNF4。

       緊接著，為了確定E3連接酶的細(xì)胞位置，研究人員整合了來自COMPARTMENTS、Gene Ontology (GO)和UniProt的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)983個(gè)E3連接酶被細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核注釋，這被認(rèn)為是PROTAC的首選位置。這些潛在的新型E3連接酶，為實(shí)現(xiàn)受限或需要降解的亞細(xì)胞定位提供了一種通用的選擇。

       最后，研究人員從多種來源收集到跨越928個(gè)E3連接酶，包括11個(gè)增選的E3連接酶的PPI界面。基于此可以指導(dǎo)人們確定E3連接酶或靶標(biāo)中觀察到的突變是否位于界面區(qū)域，從而可能進(jìn)一步破壞E3連接酶與靶標(biāo)的相互作用。

       PART.

       05

       局限與展望

       然而，此研究目前也有一定的局限性，首先針對(duì)E3連接酶的研究主要集中在有限數(shù)量的E3連接酶上，如VHL/CRBN，缺少其他蛋白經(jīng)驗(yàn)；其次由于目前缺乏大規(guī)模的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，無(wú)法更高分辨分析E3連接酶的活性，最后翻譯后修飾(PTM)在調(diào)節(jié)E3連接酶的活性和豐度（豐度指的是E3連接酶的相對(duì)含量）方面也起著關(guān)鍵作用。

       PTM對(duì)PROTAC中E3的調(diào)控作用在很大程度上是未知的，大規(guī)模的高分辨率PTM數(shù)據(jù)還無(wú)法實(shí)現(xiàn)。因此，該網(wǎng)站為用戶提供了根據(jù)他們的偏好選擇數(shù)據(jù)源的選項(xiàng)。除了為PROTAC尋找新的E3連接酶外，E3連接酶的信息也可以被其他TPD領(lǐng)域所利用，如蛋白水解靶向抗體(PROTAB)和分子膠。

       總之，該研究通過分析30個(gè)大規(guī)模數(shù)據(jù)集，從7個(gè)不同的方面系統(tǒng)地表征了E3連接酶，包括化學(xué)配體性、表達(dá)模式、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)、結(jié)構(gòu)可用性、功能必要性、細(xì)胞位置和PPI接口。揭示了幾種有前途的現(xiàn)存的E3連接酶。綜合置信度評(píng)分、配位性、表達(dá)模式和PPI，確定了76個(gè)E3連接酶作為PROTAC相互作用的候選酶。

       此外，盡管新開發(fā)的PROTAC大部分用于癌癥治療，但研究人員對(duì)E3連接酶的綜合分析也可以從癌癥轉(zhuǎn)移到其他領(lǐng)域的治療開發(fā)，例如：治療神經(jīng)和/或免疫疾病。期待E3連接酶能夠持續(xù)助力PROTAC藥物的開發(fā)，造福更多患者！