南極位于地球最南端，氣候嚴(yán)寒，風(fēng)力凜冽，太陽輻射強(qiáng)烈，生存條件嚴(yán)苛，其特有的凍層海洋環(huán)境使其蘊藏著十分獨特的微生物資源[1]。為了適應(yīng)極地特有的環(huán)境，這些微生物在基因的轉(zhuǎn)錄、蛋白的表達(dá)及代謝調(diào)控方面有著獨特的機(jī)制，具有產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎活性化合物的潛力[2-4]。文獻(xiàn)研究表明，節(jié)菱孢屬真菌Arthrinium sp.能夠產(chǎn)生多樣的次級代謝產(chǎn)物，涵蓋了苯并色原酮類[5-6]、香豆素類[7-8]、生物堿類[9-10]、萜類[11]、甾體類[12]等，且這些化合物具有抗菌、抗病毒、細(xì)胞毒等生物活性。

       本研究對南極來源真菌Arthrinium arundinis（FNJ20）的次級代謝產(chǎn)物及其生物活性開展研究，從中分離鑒定出1個新構(gòu)型的二萜類化合物（–）arthrinin A（1），5個已知二萜類化合物libertellenone J（2），arthrinins B（3），arthrinin D（4），myrocin A（5），myrocin E（6）以及2個苯并色原酮類化合物conioxanthone A（7），1,3,6-tri-hydroxy-8-methylxanthone（8）（見圖1），并對化合物進(jìn)行了抗菌活性評價。

       01

       實驗部分

       1.1儀器與試劑

       LaChrom Elite高效液相色譜儀（日本日立公司）；Micromass Q-TOF質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；Agilent DD2 500 MHz型核磁共振波譜儀（美國Agilent公司）；X-單晶衍射儀（德國Bruker公司）；Laborota 2 000/4 000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidoph公司）；MIR-253 SANYO恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（奧地利Tecan公司）；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；Sephadex LH-20凝膠色譜填料（美國Amersham公司）；硅膠（200~300目，青島海洋化學(xué)公司）。

       酵母膏，瓊脂，葡萄糖，甘油，DMSO（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；環(huán)丙沙星（上海麥克林生化科技有限公司，生產(chǎn)批號201424）；高效液相色譜儀專用色譜純甲醇（天津四友精細(xì)化工公司）；氘代試劑（美國CIL公司）；提取分離所用甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚等均為工業(yè)純產(chǎn)品。

       1.2菌株來源

       菌株分離自南極海泥。經(jīng)過真菌形態(tài)和ITS序列比對，確定為真菌Arthrinium arundinis。目前該菌株保存于中國海洋大學(xué)海洋藥用生物資源室，菌株編號為FNJ20，于甘油中?80℃保存。

       1.3菌株發(fā)酵

       從節(jié)菱孢屬真菌A.arundinis（FNJ20）菌種凍存管中，將菌種接種到土豆培養(yǎng)基（PDA）平板上復(fù)蘇，然后將平板上復(fù)蘇好的菌株瓊脂小塊接種到大米固體培養(yǎng)基（30 g大米，30 g/1 000 mL的海水約30 mL）中，共發(fā)酵200瓶，室溫靜置培養(yǎng)45d。

       1.4提取與分離

       將發(fā)酵后的菌體用乙酸乙酯浸泡3次，再用二氯甲烷-甲醇（體積比1∶1）浸泡1次，濃縮得到浸膏（270 g）。首先用減壓柱對浸膏梯度洗脫，最終獲得5個組分（Fr.1~5）。組分Fr.2經(jīng)過正相柱色譜分離、凝膠柱色譜Sephadex LH-20（洗脫體系為石油醚-二氯甲烷-甲醇，體積比2∶1∶1）分離得到組分Fr.2.1~2.3，組分Fr.2.1經(jīng)過半制備型高效液相色譜（甲醇-水，體積比9∶1，流速2 mL/min）制備得到化合物1（18.9 mg）。組分Fr.2.3經(jīng)過半制備型高效液相色譜（甲醇-水，體積比9∶1，流速2 mL/min）制備得到化合物2（15.5 mg）。將組分Fr.3經(jīng)過硅膠柱色譜分離、凝膠柱層析Sephadex LH-20（洗脫體系為二氯甲烷-甲醇，1∶1），洗脫得到組分Fr.3.1~3.3。組分Fr.3.1經(jīng)半制備高效液相色譜（甲醇-水，體積比8∶2，流速2 mL/min）得到化合物3（9.8 mg）和4（9.2 mg）。組分Fr.3.2經(jīng)半制備高效液相色譜（甲醇-水，體積比8∶2，流速2 mL/min）得到化合物5（18.3 mg）和6（7.8 mg）。組分Fr.3.3經(jīng)半制備高效液相色譜（甲醇-水，體積比7∶3，流速2 mL/min）得到化合物7（15.0 mg）和8（8.2 mg）。

       1.5抗菌活性評價

       以微量稀釋法[13-14]進(jìn)行化合物的抗菌活性測定。測試菌株包括金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Psmdomonas aeruginosa）、白色念珠菌（Candida albicans）。陽性對照為環(huán)丙沙星，陰性對照為DMSO溶液，每個化合物設(shè)置3個平行。

       02

       結(jié)果與討論

       2.1化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

       化合物1：無色晶體，HRESIMS在m/z 327.158 9處給出[M+H]＋峰，確定分子式為C20H22O4，不飽和度為10。在其1 H NMR和13C NMR譜中，δH 1.01（1H，t，J=4.40 Hz，H-20a）和δH 0.68（1H，dd，J=8.55，4.75 Hz，H-20b）處的氫信號及δC 14.5（C-20）、δC 21.3（C-1）和δC 23.3（C-10）處的碳信號，提示了化合物1有環(huán)丙基結(jié)構(gòu)。此外，還有1個羰基信號（δC 182.7），1個末端乙烯基信號δC 136.1，δH 6.94（1H，dd，J=11.24，17.98 Hz，H-15）；δC 120.7，δH 5.39（1H，dd，J=11.24，2.32 Hz，H-16a）和δH 5.10（1H，dd，J=17.98，2.32 Hz，H-16b），2個次甲基信號和2個甲基信號。根據(jù)以上的核磁數(shù)據(jù)推測化合物1為二萜類化合物，且該化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道已知化合物arthrinin A一致[15]，由此1的平面結(jié)構(gòu)得以確定。以正己烷-甲醇（體積比1∶1）溶解化合物，室溫緩慢揮發(fā)溶劑獲得單晶，通過銅靶單晶衍射獲得其單晶數(shù)據(jù)（見圖2），并已經(jīng)提交到劍橋晶體數(shù)據(jù)中心，CCDC號為1992569。對單晶數(shù)據(jù)進(jìn)行分析確定化合物1的一定構(gòu)型為1S,4S,5R,6R,7R,10S，與文獻(xiàn)報道的arthrinin A的構(gòu)型相反，最終將化合物1命名為（–）-arthrinin A。

       化合物2~6：均為已知的二萜類化合物，其質(zhì)譜、核磁及旋光數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致，分別確定為libertellenone J（2）[16]，arthrinin B（3）[15]，arthrinin D（4）[15]，myrocin A（5）[17]和myrocinE（5）[16]。

       化合物7：白色粉末狀固體。ESI-MS在m/z 317處給出[M+H]+峰，提示分子質(zhì)量為316。1H NMR譜顯示了4個均為單峰的芳香氫信號（δH 6.73，6.74，6.82，6.94），13C NMR譜顯示了2個苯環(huán)上連羥基的碳信號（δC 162.9，167.9）和1個羰基碳信號（δC 181.0），這提示了苯并色原酮骨架的存在。另外，1H NMR和13C NMR譜還顯示了1個甲氧基（δC 53.6，δH 3.96），1個亞甲基（δC64.6，δH 4.67）的存在。結(jié)合以上信息，對比文獻(xiàn)[18]的核磁數(shù)據(jù)，確定了化合物為conioxanthone A?；衔?：黃色粉末狀固體。ESI-MS在m/z259處給出[M+H]+峰，提示分子質(zhì)量為258。其1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)與7的相似，也顯示了苯并色原酮骨架特征信號。結(jié)合以上信息，對比文獻(xiàn)[19]的核磁數(shù)據(jù)，確定了化合物為1,3,6-tri-hydroxy-8-methylxanthone。

       2.2化合物波譜數(shù)據(jù)

       Arthrinin A（1）：C20H22O4，1 H NMR（500 MHz，Methanol-d4，δ，J/Hz）δH 6.94（1H，dd，J=11.24，17.98 Hz，H-15），6.48（1H，s，H-12），5.39（1H，dd，J=11.24，2.32 Hz，H-16a），5.24（1H，d，J=7.76 Hz，H-7），5.10（1H，dd，J=17.98，2.32 Hz，H-16b），4.52（1H，dd，J=11.94，7.76 Hz，H-6），3.18（1H，ddt，J=8.91，4.11，2.56 Hz，H-1），2.19（1H，d，J=11.94 Hz，H-5），2.16（3H，s，H-17），2.03（1H，m，H-2a），1.83（1H，dq，J=14.08，3.10 Hz，H-2b），1.57（1H，td，J=13.73，3.75 Hz，H-3a），1.43（1H，m，H-3b），1.27（3H，s，H-18），1.01（1H，t，J=4.40 Hz，H-20a），0.68（1H，dd，J=8.55，4.75 Hz，H-20b）。13C NMR（125 MHz，Methanol-d4，δ）δC 182.7（C-19），150.2（C-11），139.2（C-8），136.1（CH-15），135.0（C-13），132.4（C-14），129.9（C-9），120.7（CH2-16），117.3（CH-12），84.9（CH-6），74.4（CH-7），47.0（CH-5），39.1（C-4），27.8（CH3-18），23.3（C-10），22.8（CH2-3），21.3（CH-1），20.5（CH2-2），20.2（CH3-17），14.5（CH2-20）。HRESIMS m/z 327.158 9[M+H]＋，m/z 349.140 8[M+Na]＋，m/z 365.115 1[M+K]＋，[α]2 5 D–7.87（c=0.1，MeOH）。

       Libertellenone J（2）：C21H28O6，1 H NMR（500MHz，Methanol-d4，δ，J/Hz）δH 7.00（1H，d，J=1.87 Hz，H-14），5.93（1H，dd，J=17.49，10.67 Hz，H-15），5.13（1H，dd，J=17.49，1.05 Hz，H-16a），5.06（1H，dd，J=10.67，1.05 Hz，H-16b），4.35（1H，dd，J=10.95，4.76 Hz，H-1），3.64（3H，s，H-21）2.23（1H，td，J=14.50，3.32 Hz，H-11a），2.10（1H，dt，J=14.50，3.32 Hz，H11b），1.96（1H，dd，J=13.13，3.88 Hz，H-3a），1.88（1H，m，H-2），1.81（1H，m，H-12），1.65（1H，ddd，J=12.83，4.21，2.18 Hz，H-3b），1.57（1H，m，H-12），1.50（3H，s，H-18），1.22（3H，s，H-20），1.16（3H，s，H-17）。13C NMR（151 MHz，Methanol-d4，δ）δC 182.9（C-7），180.3（C19），148.9（CH-14），147.6（CH-15），146.1（C-6），140.5（C-5），135.9（C-8），112.8（CH2-16），76.4（C-9），69.7（CH-1），52.9（CH3-21），50.3（C-10），47.6（C-4），39.7（C-13），35.3（CH2-3），31.0（CH2-12），29.8（CH2-11），28.7（CH2-2），23.8（CH3-17），22.3（CH3-18），22.9（CH3-20）。ESI-MS m/z:377[M+H]+，[α]2 5 D–32.7（c=0.1，MeOH）。

       Arthrinin B（3）：C20H22O3，1 H NMR（500 MHz，Methanol-d4，δ，J/Hz）δH 7.00（1H，s，H-14），6.61（1H，dd，J=18.08，11.50 Hz，H-15），5.60（1H，dd，J=11.50，1.99 Hz，H-16b），5.41（1H，dd，J=18.08，1.99 Hz，H-16a），4.93（1H，d，J=8.71 Hz，H-7），4.43（1H，dd，J=11.41，8.71 Hz，H-6），3.16（1H，ddt，J=9.00，4.16，2.56 Hz，H-1），2.27（1H，d，J=11.41 Hz，H-5），2.22（3H，s，H-17），2.07（1H，td，J=13.83，3.35 Hz，H-2b），1.84（1H，dq，J=14.11，3.08 Hz，H-2a），1.60（1H，td，J=13.83，3.35 Hz，H-3a），1.46（1H，dt，J=14.11，3.08 Hz，H-3b），1.29（3H，s，H-18），1.02（1H，t，J=4.38 Hz，H-20a），0.60（1H，dd，J=8.60，4.71 Hz，H-20b）。13C NMR（125 MHz，Methanol-d4，δ）δC 183.6（C-19），149.0（C-11），139.1（C-8），133.4（C-13），131.5（CH-15），130.1（CH-9），125.2（C-12），122.7（CH-14），120.1（CH2-16），85.5（CH-6），75.5（CH-7），47.2（CH-5），39.0（C-4），27.1（CH3-18），23.6（C-10），22.7（CH2-3），21.3（CH-1），20.0（CH2-2），19.2（CH3-17），14.0（CH2-20）。ESIMS m/z 311[M+H]+，[α]2 5 D+14.2（c=0.1，MeOH）。

       Arthrinin D（4）：C20H24O5，1 H NMR（500 MHz，Methanol-d4，δ，J/Hz）δH 6.73（1H，dd，J=17.84，11.34 Hz，H-15），6.56（1H，d，J=0.92 Hz，H-12），5.49（1H，dd，J=11.34，2.29 Hz，H-16a），5.34（1H，dd，J=17.84，2.29 Hz，H-16b），5.13（1H，s，H-7），3.58（1H，q，J=7.05 Hz，H-6），2.15（3H，s，H-17），2.32（1H，s，H-5），1.99（1H，tdd，J=12.49，4.54，2.48 Hz，H-3a），1.77（1H，m，H-3b），1.72（1H，dd，J=14.37，4.68 Hz，H-2a），1.45（1H，ddd，J=14.37，4.46，2.48 Hz，H-2b），1.38（3H，s，H-18），1.15（1H，t，J=7.05 Hz，H-1），0.89（1H，t，J=5.51 Hz，H=20a），0.43（1H，dd，J=8.43，5.89 Hz，H-20b）。13C NMR（125 MHz，Methanol-d4，δ）δC 183.3（C-19），152.3（C-11），137.3（C-9），134.6（C-14），134.2（CH-15），131.2（C-8），118.8（CH2-16），117.8（CH-12），72.0（CH-7），57.0（CH-6），52.6（CH-5），41.7（C-4），28.2（CH3-18），26.8（CH2-2），19.3（CH3-17），18.6（CH2-3），17.9（C-13），17.0（CH-1），16.6（C-10），14.3（CH2-20）。ESI-MS m/z:345[M+H]+，367[M+Na]+，[α]2 5 D+24.6（c=0.1，MeOH）。

       Myrocin A（5）：C20H22O6，1 H NMR（500 MHz，Acetone-d6，δ，J/Hz）δH 6.83（1H，d，J=1.57 Hz，H-14），5.69（1H，dd，J=17.67，10.31 Hz，H-15），5.01（1H，d，J=1.38 Hz，H-16a），4.98（1H，dd，J=5.00，0.75 Hz，H-16b），2.90（1H，d，J=13.42 Hz，H-12a），2.52（1H，dd，J=13.42，1.57 Hz，H-12b），2.07（1H，m，H-2a），1.84（1H，m，H-2b），1.82（1H，m，H-3a），1.79（1H，m，H-1），1.44（1H，m，H-3b），1.43（3H，s，H-17），1.42（3H，s，H-19），1.09（1H，t，J=6.28 Hz，H-20a），0.83（1H，dd，J=8.97，6.28 Hz，H-20b）。13C NMR（125 MHz，Acetone-d6，δ）δC 208.8（C-11），182.9（C-7），177.8（C-19），145.1（C-6），143.8（CH-14），142.7（CH-15），137.5（C-8），132.6（C-5），115.2（CH2-16），76.7（C-9），53.9（CH2-12），44.9（C-4），43.3（C-13），29.8（CH2-3），27.6（C-10），27.5（CH3-17），20.0（CH3-18），18.2（CH2-2），16.9（CH-1），12.4（CH2-20）。ESI-MS m/z：359[M+H]+，381[M+Na]+，[α]2 5 D–32.1（c=0.1，MeOH）。

       Myrocin E（6）：C20H24O6，1 H NMR（500 MHz，Acetone-d6，δ，J/Hz）δH 6.82（1H，d，J=1.43 Hz，H-14），5.83（1H，dd，J=17.47，10.57 Hz，H-15），5.03（1H，dd，J=17.47，1.10 Hz，H-16a），4.98（1H，dd，J=10.57，1.10 Hz，H-16b），3.91（1H，d，J=3.93 Hz，H-11），3.47（1H，d，J=1.13 Hz，H-5），2.87（1H，m，H-12a），2.36（1H，dd，J=14.27，2.49 Hz，H-1），1.78（1H，m，H-3a），1.76（1H，m，H-2a），1.74（1H，m，H-2b），1.66（1H，ddd，J=14.25，3.72，1.43 Hz，H-12b），1.48（3H，s，H-19），1.44（1H，m，H-3b），1.33（3H，s，H-17），0.63（1H，dd，J=6.33，3.99 Hz，H-20a），0.14（1H，t，J=14.87 Hz，H-20b）。13C NMR（125 MHz，Acetone-d6，δ）δC 193.3（C-7），182.9（C-18），148.4（CH-14），147.4（CH-15），133.7（C-8），112.3（CH2-16），97.2（C-6），72.7（C-9），69.4（CH-11），47.3（CH-5），41.8（C-4），39.7（C-13），39.1（CH2-12），29.7（CH3-19），29.6（CH2-3），27.2（CH3-17），25.1（C-10），19.5（CH2-2），14.4（CH-1），7.4（CH2-20）。ESI-MS m/z:361[M+H]+，383[M+Na]+，[α]2 5 D–8.37（c=0.1，MeOH）。

       Conioxanthone A（7）：C16H12O7，1 H NMR（500 MHz，Methanol-d4，δ，J/Hz）δH 6.94（1H，s，H-4），6.82（1H，s，H-5），6.74（1H，s，H-7），6.73（1H，s，H-2），4.67（2H，s，H-10），3.96（3H，s，H-12）。13C NMR（125 MHz，Methanol-d4，δ）δC 181.0（C-9），171.7（C-11），167.9（C-6），162.9（C-1），160.1（C-5a），157.6（C-4a），153.6（C-3），136.7（C8），115.0（CH-7），109.0（CH-2），108.4（C-8a），108.1（C-1a），105.4（CH-4），104.7（CH-5），64.6（CH2-10），53.6（CH3-12）。ESIMS m/z:339[M+Na]+。

       1，3，6-trihydroxy-8-methylxanthone（8）：C14H10O5，1 H NMR（500 MHz，Methanol-d4，δ，J/Hz）δH 6.57（1H，s，H-2），6.56（1H，s，H-4），6.08（1H，d，J=2.19 Hz，H-5），6.19（1H，d，J=2.19 Hz，H-7），2.74（3H，s，H-11）。13C NMR（125 MHz，Methanol-d4，δ）δC 183.6（C-9），166.2（C-6），165.0（C-8），164.4（C-3），161.0（C-4a），158.8（C-10a），144.9（C-1），117.2（CH-2），113.0（C-1a），104.2（C-9a），101.7（CH-4），99.0（CH-7），94.4（CH-5），23.7（CH3-11）。ESIMS m/z:259[M+H]+。

       2.3化合物1單晶數(shù)據(jù)

       C20H22O4（M），Mr=326.37，該晶體為單斜晶，所在空間群為P2（1）；晶胞參數(shù)為a=10.199 8（5）?，b=7.157 7（4）?，c=11.739 4（6）?，α=90°，β=103.098（5）°，γ=90°，V=834.76（8），Z=2，Dcalc=1.298 g/cm3，μ（Cu Kα）=0.726 mm–1，F(xiàn)（000）=348.0。獨立衍射點：5110（Rint=0.032 0）。R1值為0.038 6，flack常數(shù)為0.1（3），wR2=0.099 5[I>2σ（I）]，化合物1的單晶數(shù)據(jù)已經(jīng)提交到劍橋單晶數(shù)據(jù)中心，CCDC號為1992569。

       2.4抗菌活性評價

       采用微量稀釋法對分離到的化合物進(jìn)行抗菌活性評價。結(jié)果顯示，化合物8具有對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌顯著的抑制活性，MIC值分別為6.25和12.50μmol/L。陽性對照環(huán)丙沙星的MIC值為3.125μmol/L。

       03

       結(jié)論

       本研究從南極海泥來源節(jié)菱孢屬真菌A.arundinis（FNJ20）的發(fā)酵提取物中分離并鑒定了6個二萜類化合物（1~6）及2個苯并色原酮類化合物（7~8），并通過單晶確定了化合物1的一定構(gòu)型?；衔?對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌有顯著的抑制活性，為該菌次級代謝產(chǎn)物的進(jìn)一步應(yīng)用提供了基礎(chǔ)資料。