伴隨著全球的新冠大流行，新冠疫苗備受關(guān)注。目前市面上的新冠疫苗有三個(gè)類型：傳統(tǒng)滅活疫苗、腺病毒載體疫苗以及信使RNA (mRNA)疫苗。傳統(tǒng)的滅活疫苗我們比較了解，它是將經(jīng)過處理、沒有傳染性和致病性的病原體注入人體，讓免疫系統(tǒng)認(rèn)識(shí)這種病原體，從而達(dá)到預(yù)防的目的。腺病毒載體疫苗是用另外一種非復(fù)制型的病毒將想要免疫的病原體DNA注入人體。相較于這兩種疫苗，mRNA疫苗更具設(shè)計(jì)與制造的簡(jiǎn)便性、固有的免疫原性、快速量產(chǎn)性等優(yōu)勢(shì)。

       而且隨著生物技術(shù)和分子醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，mRNA引入人體作為疫苗或治療劑能夠產(chǎn)生幾乎所有功能性蛋白，這代表著一個(gè)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域正在崛起，其在預(yù)防和治療許多難治性疾病方面前景廣闊。因此，小編今天和大家分享之前發(fā)表在Signal Transduction and Targeted Therapy雜志上（IF:18.817）的關(guān)于mRNA治療的綜述，為大家進(jìn)一步介紹mRNA治療的現(xiàn)狀。

       基于mRNA的治療：對(duì)抗疾病的強(qiáng)大和通用工具

       01

       mRNA的設(shè)計(jì)與制造

       mRNA治療的發(fā)展主要包括mRNA的設(shè)計(jì)、合成、包封、藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)、體內(nèi)和體外安全性評(píng)價(jià)、生產(chǎn)和臨床試驗(yàn)(圖2，表1)。其中mRNA的設(shè)計(jì)和合成是關(guān)鍵步驟，想要獲得高度生物活性RNA也通常依賴于可靠的設(shè)計(jì)。因此，在這一部分，作者重點(diǎn)關(guān)注并討論了mRNA設(shè)計(jì)和制造。并從以下幾點(diǎn)進(jìn)行了介紹：

       mRNA的結(jié)構(gòu)成分

       要了解mRNA治療，首先要了解mRNA結(jié)構(gòu)。mRNA是由轉(zhuǎn)錄過程產(chǎn)生的，真核生物中RNA聚合酶在體內(nèi)將基因轉(zhuǎn)化為初級(jí)mRNA轉(zhuǎn)錄本時(shí)合成前體mRNA，通過加工進(jìn)一步成為成熟mRNA 。成熟mRNA包括編碼區(qū)、非編碼區(qū)（UTR）、poly(A)尾和5′帽結(jié)構(gòu)，它們可以被核糖體識(shí)別并被tRNA攜帶產(chǎn)生蛋白質(zhì)。

       與DNA一樣，mRNA中的遺傳信息包含在核苷酸序列中，這些核苷酸排列成密碼子，每個(gè)密碼子由三個(gè)核糖核苷酸組成。因此，通過刺激真核細(xì)胞mRNA合成機(jī)制來完成體外RNA轉(zhuǎn)錄，能夠確保mRNA在體內(nèi)的表達(dá)(圖3)。所以mRNA的優(yōu)化對(duì)于成功的mRNA治療至關(guān)重要。

       mRNA翻譯和衰變

       真核mRNA翻譯起始是一個(gè)精細(xì)調(diào)控的過程，涉及到組裝一個(gè)多蛋白及RNA復(fù)合物，指導(dǎo)核糖體到起始密碼子。而mRNA在核糖體中會(huì)被解碼，產(chǎn)生特定的氨基酸鏈。研究發(fā)現(xiàn)翻譯過程和mRNA衰變過程之間存在一種平衡（圖4）。先前的研究表明，結(jié)構(gòu)元件與mRNA的衰變密切相關(guān)，尤其是5 '帽和poly(A)尾?；谶@些功能元件的重要性，有大量研究集聚焦于mRNA結(jié)構(gòu)的優(yōu)化，如開發(fā)一系列5 '帽類似物、改變poly(a)尾長(zhǎng)度等。

       mRNA設(shè)計(jì)

       這一部對(duì)mRNA設(shè)計(jì)進(jìn)行了介紹。首先介紹的是5 '帽。5 '帽位于mRNA的5 '端，甲基化程度不同（圖5），許多mRNA結(jié)構(gòu)優(yōu)化策略致力于優(yōu)化帽類似物。接著介紹的是poly(A)尾。Poly(A)尾通常由10-250個(gè)腺嘌呤核糖核苷酸組成。Poly(A)尾是mRNA的動(dòng)態(tài)添加物，其的長(zhǎng)度對(duì)mRNA翻譯效果和蛋白表達(dá)起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。

       此外，作者也介紹了5′-UTRs和3′-UTRs。mRNA 3′和5′末端的UTRs不編碼蛋白但在調(diào)控mRNA翻譯和蛋白表達(dá)中起重要作用。UTRs參與mRNA的亞細(xì)胞定位，調(diào)節(jié)mRNA的翻譯效率和穩(wěn)定性。5′-UTRs和3′-UTRs共同調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，5′-UTRs主要參與啟動(dòng)翻譯過程，而3′-UTRs主要影響mRNA的穩(wěn)定性和半衰期。作者也對(duì)開放閱讀框（ORF）進(jìn)行了介紹，ORF的設(shè)計(jì)主要集中在密碼子的優(yōu)化和功能肽的引入以及復(fù)制過程。

       RNA化學(xué)式設(shè)計(jì)

       這一部分作者主要介紹了兩類RNA。首先是自擴(kuò)增RNA (Self-amplifying RNA, saRNA)：與傳統(tǒng)mRNA相比，saRNA是另一種結(jié)構(gòu)不同的mRNA分子。saRNA主要來源于甲病毒，通過替換病毒結(jié)構(gòu)蛋白的基因序列編碼來構(gòu)建。因此，saRNA可以利用甲病毒的先天特性，以一種有效的方式產(chǎn)生大量感興趣的蛋白質(zhì)。

       其次是環(huán)狀RNA、非編碼RNA和競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA：環(huán)狀RNA (circRNAs)是單鏈、共價(jià)閉合的RNA分子，在從病毒到哺乳動(dòng)物中普遍存在。CircRNAs可作為蛋白質(zhì)誘餌、支架和招募者，通過充當(dāng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、microRNA海綿和蛋白質(zhì)模板發(fā)揮生物功能。環(huán)狀RNA 獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其具有更大的穩(wěn)定性、更長(zhǎng)的半衰期和更大的RNase R抗性，這是線性mRNA缺乏和期望的。

       mRNA的制造

       針對(duì)mRNA的制造，作者主要對(duì)RNA的合成與優(yōu)化進(jìn)行了介紹。體外轉(zhuǎn)錄(IVT) mRNA是用線性化質(zhì)粒DNA模板或PCR模板進(jìn)行的，需要至少一個(gè)啟動(dòng)子和相應(yīng)的mRNA構(gòu)建序列。獲得mRNA的過程需要加帽，通常采用兩種方法：共轉(zhuǎn)錄加帽和轉(zhuǎn)錄后加帽。而IVT mRNA的Poly(A)尾通常編碼在DNA模板中或通過酶促作用附著在IVT mRNA上。當(dāng)poly(A)尾延伸編碼在模板載體中時(shí)，會(huì)出現(xiàn)懸臂，這妨礙了IVT mRNA的翻譯效果，需要通過IIS型限制性內(nèi)切酶替換II型限制性內(nèi)切酶來避免。

       mRNA純化

       IVT mRNA合成后會(huì)與RNA聚合酶和DNA模板混合，因此純化IVT mRNA是必要的，包括去除免疫刺激污染物，游離核糖核苷酸，短mRNA和DNA模板。一般情況下，會(huì)用DNA酶降解多余的DNA模板。商業(yè)純化試劑盒則用于純化和分離合成的mRNA，然后乙醇或異丙醇沉淀可以去除大部分污染物，以獲得高純度的mRNA，然后用高濃度的LiCl或醇基沉淀、色譜法，或從硅膠膜柱中洗脫，可以去除蛋白質(zhì)、游離核苷酸及其他成分，但不能去除dsRNA雜質(zhì)。為了去除轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中的dsRNA污染物，一種新的純化方法RNase III被提出，其能夠顯著降低mRNA的免疫原性。

       綜上所述，純化mRNA的方法多種多樣，純度要求和尺度不同，應(yīng)根據(jù)研究或應(yīng)用的目的而定。顯然，無論使用何種方法進(jìn)行純化，嚴(yán)格的mRNA質(zhì)量控制是確保mRNA治療最大效益的核心。

       02

       mRNA運(yùn)載系統(tǒng)

       mRNA的傳遞仍然是當(dāng)前基于mRNA治療的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。因此在文章的第二大部分作者列出了多種mRNA運(yùn)載系統(tǒng)，并從多個(gè)角度對(duì)運(yùn)載系統(tǒng)進(jìn)行了介紹。

       1.mRNA運(yùn)載體

       文章首先就對(duì)運(yùn)載mRNA的脂質(zhì)納米粒進(jìn)行介紹（圖6）。首先介紹的是陽離子固體脂質(zhì)納米粒，陽離子脂類廣泛用于mRNA傳遞。接著作者又介紹了可電離脂質(zhì)納米顆粒，有研究已經(jīng)將可電離的氨基脂質(zhì)Dlin-MC3- DMA (MC3)用于臨床治療。接著介紹的是具有免疫刺激作用的脂質(zhì)納米顆粒，有研究開發(fā)了具有環(huán)狀氨基頭基團(tuán)的脂質(zhì)，可激活細(xì)胞內(nèi)STING通路，會(huì)顯著延長(zhǎng)了生存期，增強(qiáng)了抗腫瘤療效。

       其次是，聚合物納米顆粒：聚合化合物及其衍生物可以由天然或合成材料合成，具有多種可能的結(jié)構(gòu)和特性。其中PEI是最有效的非病毒基因載體之一。此外還有，陽離子納米乳劑：1990年，CNEs被提出作為一種潛在的核酸輸送系統(tǒng)，已被證明可以有效地輸送核酸用于各種疾病的治療。其中在配方中加入陽離子脂質(zhì)是通過靜電作用進(jìn)行核酸絡(luò)合的必要條件，這對(duì)于提高核酸的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率，防止核酸被核酸酶降解也是必不可少的。

       最后是，其他mRNA傳遞系統(tǒng)：也有一些其他類型的載體被開發(fā)用于傳遞mRNA，其中包括精蛋白濃縮mRNA、外泌體、細(xì)胞外囊泡(ev)、介孔二氧化硅、CaP等。

       2.影響mRNA運(yùn)載的其他因素

       接下來文章對(duì)影響mRNA運(yùn)載系統(tǒng)的其他因素進(jìn)行了介紹。其中包括：體外和體內(nèi)mRNA傳遞的屏障，mRNA傳遞的屏障一直是該領(lǐng)域思考的重點(diǎn)，研究者通過增加細(xì)胞攝取，促進(jìn)溶酶體逃逸，加速翻譯來最大限度地提供mRNA。研究發(fā)現(xiàn)mRNA在納米顆粒的幫助下進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)涉及多個(gè)步驟:包括內(nèi)吞作用、溶酶體逃逸和mRNA釋放，其中細(xì)胞膜是細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)囊粋€(gè)動(dòng)態(tài)和強(qiáng)大的屏障。而納米顆粒會(huì)通過多種機(jī)制與細(xì)胞膜相互作用。

       此外，了解mRNA的細(xì)胞攝取機(jī)制是mRNA高效傳遞的前提。mRNA傳遞系統(tǒng)的佐劑活性：陽離子脂質(zhì)體本身作為佐劑，其主要功能是保護(hù)抗原不被清除，并將抗原傳遞給專業(yè)的APCs。管理路徑對(duì)傳遞效率的影響：給藥途徑在mRNA給藥系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用，因?yàn)橐恍┨囟ǖ募膊⌒枰囟ǖ慕o藥途徑，盡管靜脈給藥可以滿足大多數(shù)疾病的需要，但肺部疾病等則宜采用吸入或氣管內(nèi)給藥。此外，不同給藥載體在不同給藥路徑下的分布或表達(dá)也不同。

       03

       mRNA治療的應(yīng)用

       基于mRNA的治療有望成為多種難治性疾病的有力治療手段，包括傳染性疾病、代謝性遺傳疾病、癌癥、心腦血管疾病和其他疾病(圖7，表2)。因此，在這一部分作者對(duì)mRNA治療的應(yīng)用進(jìn)行了詳細(xì)介紹。主要包括以下幾種：

       1.直接基于編碼分子的mRNA療法

       以mRNA為基礎(chǔ)的免疫治療通過表達(dá)抗原然后啟動(dòng)免疫反應(yīng)，被定義為一種間接治療，其不以病毒或腫瘤細(xì)胞的mRNA編碼治療蛋白。而mRNA療法通過傳遞基于mRNA的功能性蛋白直接治療疾病則是一種直接策略，這些功能蛋白主要包括缺失或下調(diào)內(nèi)源性蛋白、功能性外源蛋白或抗體，以及用于基因編輯工具的蛋白。

       2.基于mRNA單克隆抗體及免疫療法

       以抗體為基礎(chǔ)的藥物在生物制藥領(lǐng)域取得了快速的進(jìn)展，但單克隆抗體的脆弱特性以及高昂的生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和分銷成本限制了其在世界范圍內(nèi)的應(yīng)用。核酸編碼的單克隆抗體，特別是基于mRNA的單克隆抗體，則為提高抗體治療效果帶來了很大希望。

       此外，作者回顧了基于mRNA的藥物應(yīng)用，重點(diǎn)是預(yù)防和治療傳染病和癌癥的疫苗的臨床試驗(yàn)(圖8)。其中抗傳染病的mRNA疫苗中最經(jīng)典的例子是SARS-CoV-2 mRNA疫苗:2019年SARS-CoV-2出現(xiàn)，并在全球范圍內(nèi)引發(fā)大流行，首 個(gè)COVID-19疫苗被FDA批準(zhǔn)緊急使用授權(quán)（圖9）。

       除此，也包括流感病毒mRNA疫苗、HIV mRNA疫苗、呼吸道合胞體病毒（RSV）mRNA疫苗、單純性皰疹病毒(HSV) mRNA疫苗、水痘帶狀皰疹病毒(VZV) mRNA疫苗、人巨細(xì)胞病毒(HCMV)mRNA疫苗、狂犬病毒mRNA疫苗、登革病毒mRNA疫苗。而癌癥疫苗則包括;黑色素瘤疫苗、惡性膠質(zhì)瘤疫苗、急性髓性白血病疫苗、腎細(xì)胞癌疫苗等。

       mRNA癌癥疫苗的耐受性及安全性

       研究發(fā)現(xiàn)新表位可以繞過具有高免疫原性的中心耐受性，因?yàn)樗鼈儚牟怀霈F(xiàn)在正常組織中，并在癌細(xì)胞中產(chǎn)生基因突變的積累。因此，新表位被用于克服癌癥疫苗的中心耐受性和解決腫瘤異質(zhì)性的問題。而且mRNA疫苗也具有足夠的安全性，其不良事件一般為輕至中度，包括注射部位反應(yīng)，如疼痛、腫脹、紅斑和流感樣疾病，如疲勞、肌痛、發(fā)熱和寒戰(zhàn)。

       4.mRNA疫苗佐劑

       佐劑對(duì)于基于mRNA的治療至關(guān)重要，尤其是mRNA疫苗，它可以放大和直接免疫應(yīng)答。FDA批準(zhǔn)了幾種用于人體的佐劑，包括鋁鹽、MF59、AS01、AS03、AS04等。

       5.基于mRNA的蛋白質(zhì)替代療法

       蛋白質(zhì)替代處理在用有利蛋白替代缺失或缺陷蛋白方面有著廣泛的應(yīng)用?；趍RNA的治療方法已成為蛋白質(zhì)替代治療的新支柱，在多個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的探索，包括心臟病、肺部疾病、血液系統(tǒng)疾病、代謝性疾病、癌癥、骨科疾病、神經(jīng)源性疾病、肌肉萎縮等。

       6.mRNA編碼肽及蛋白質(zhì)

       mRNA編碼的肽和蛋白的功能是選擇靶向細(xì)胞治療藥物的關(guān)鍵因素，直接影響mRNA的治療設(shè)計(jì)。對(duì)于需要翻譯后修飾以組裝成功能類型多肽的細(xì)胞，需要使用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)轉(zhuǎn)化酶或內(nèi)蛋白酶來精確傳遞。而蛋白質(zhì)則需要分泌到細(xì)胞外才能發(fā)揮其功能。因此，mRNA需要被傳遞到具有自然分泌功能的細(xì)胞中，否則需要將相應(yīng)信號(hào)肽mRNA序列插入到分泌蛋白的ORF附近。

       7.基于mRNA的基因編輯療法及CRISPR/Cas核酸酶系統(tǒng)

       mRNA被廣泛用于傳遞可編程核酸酶。mRNA具有瞬時(shí)表達(dá)、無突變風(fēng)險(xiǎn)的特點(diǎn)，是基因編輯治療中極具吸引力的方法，目前，多個(gè)基于mRNA基因編輯的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。此外，人工核酸內(nèi)切酶的發(fā)展帶動(dòng)了基于mRNA的基因編輯技術(shù)的高速發(fā)展。mRNA藥物通過編碼人工核酸內(nèi)切酶，如ZFNs、TALENs和最近的CRISPR/Cas核酸酶系統(tǒng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞基因組信息。

       8.基于mRNA的治療

       在文章最后作者對(duì)基于mRNA的治療進(jìn)行了介紹，主要包括基于mRNA的T淋巴細(xì)胞治療、基于mRNA的自體T細(xì)胞治療、基于mRNA的CD4+ T細(xì)胞治療、基于mRNA的干細(xì)胞治療、基于mRNA的多能干細(xì)胞(iPS)治療及基于mRNA藥物的聯(lián)合治療。

       小結(jié)

       到這里這篇文章的主要內(nèi)容就介紹完了，文章對(duì)基于mRNA的治療工具進(jìn)行了全面的介紹，從mRNA的結(jié)構(gòu)、制造、傳遞到應(yīng)用，全文參考文獻(xiàn)近600篇，內(nèi)容非常豐富。

       目前mRNA治療正在快速崛起，是一個(gè)非常有前景的研究領(lǐng)域，由于其在靈活性、成本和開發(fā)速度方面的優(yōu)勢(shì)，該技術(shù)為傳染病和個(gè)性化藥物提供了巨大的好處和潛力。當(dāng)然，要充分發(fā)揮這項(xiàng)技術(shù)的潛力，仍然需要克服包括缺乏擴(kuò)大mRNA過程的經(jīng)驗(yàn)和知識(shí)及靶向遞送技術(shù)等挑戰(zhàn)。