圖片圖1. 多肽N端乙?；cC端酰胺化

       多肽N端乙?；亲畛Ｒ?jiàn)的多肽化學(xué)改性增加穩(wěn)定性的手段之一。值得注意的是，截至2021年底，62個(gè)（不包括已撤消的羅穆?tīng)栯暮桶舶湍就。┮焉鲜械亩屉模ㄓ尚∮诨虻扔?5個(gè)氨基酸殘基組成）中，有37個(gè)實(shí)體在其N(xiāo)端通過(guò)酰化、焦谷氨酸或環(huán)化的方式得以封閉。在Nα沒(méi)有封閉的多肽藥物中，有11個(gè)為含二硫鍵的環(huán)肽和1個(gè)酰胺化環(huán)肽，還有一個(gè)為prodrug。從分析數(shù)據(jù)來(lái)看，截止2021年底FDA批準(zhǔn)的短肽藥物中，只有9種線性肽實(shí)際上具有自由Nα基團(tuán)。

       多肽N端封閉，除了避免外肽酶（Exopeptidase，或稱“肽鏈端解酶”）的酶解作用之外，防止多肽以DKP (diketopiperazine，二酮哌嗪）的方式化學(xué)降解，也是一個(gè)重要的原因。擁有自由Nα基團(tuán)的多肽肽鏈，可以在堿性至中性條件下通過(guò)DKP的方式進(jìn)行降解，產(chǎn)生一個(gè)六元環(huán)2，5-二酮哌嗪，以及相應(yīng)的缺失N-端二肽的縮短的肽鏈 (圖2)[1]。

       DKP是多肽合成、純化、制劑和存儲(chǔ)過(guò)程中，常見(jiàn)的降解類(lèi)型之一。為了防止外肽酶的酶促降級(jí)，以及DKP化學(xué)降解，多肽藥物尤其是較小尺寸的多肽藥物，通常借助N端乙?；忾]的方式。

       圖2. 多肽DKP降解機(jī)理

       類(lèi)似的是，在多肽C端可以使用酰胺化，將多肽C端天然的羧酸基團(tuán)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酰胺基團(tuán)，降低carboxypeptidase（羧肽酶）對(duì)于多肽C端某些特定的氨基酸的酶解（例如：羧肽酶A裂解C端的Phe、Tyr、Trp或Leu；羧肽酶B裂解C端的Lys或Arg）。若將這些C端氨基酸替換為相應(yīng)的氨基酸酰胺，羧肽酶的酶解作用或?qū)@著降低。

       02

       多肽環(huán)化

       圖3. 多肽環(huán)化模式示意圖

       多肽環(huán)化是常見(jiàn)的多肽改性，它不僅同時(shí)消除了多肽N端和C端易遭受外肽酶降解的氨基和羧基，而且可以將多肽的構(gòu)型保持在利于與受體結(jié)合的狀態(tài)，從而大大提高這些多肽的生物學(xué)活性。最新獲得FDA監(jiān)管批準(zhǔn)的新藥，治療念珠菌血癥和侵襲性念珠菌病的棘白菌素多肽類(lèi)似物——Rezafungin（圖4），就是一款環(huán)肽藥物。

       圖4. Rezafungin化學(xué)結(jié)構(gòu)

       常見(jiàn)的多肽環(huán)化方式包括：

       頭對(duì)尾酰胺環(huán)化

       頭對(duì)側(cè)鏈酰胺環(huán)化

       尾對(duì)側(cè)鏈酰胺環(huán)化

       側(cè)鏈對(duì)側(cè)鏈酰胺環(huán)化

       二硫鍵環(huán)化

       硫醚鍵環(huán)化

       三唑環(huán)化

       乙烯鍵環(huán)化

       03

       D-氨基酸替換

       D-氨基酸替換也是一種常見(jiàn)的增加多肽藥物穩(wěn)定性的手段，可以降低空間構(gòu)象依賴的酶水解。由于核糖體對(duì)L-氨基酸具有特異性，因此D-肽很少天然存在于生物體中，不易被消化或降解。D肽模擬肽是設(shè)計(jì)用于模擬通常具有治療特性的天然L肽的D肽。D-氨基酸多肽尤其在多肽抗生素的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，發(fā)揮著重要的作用[2]。

       04

       N-甲基化多肽

       N-甲基化多肽，不僅可以增加多肽的化學(xué)穩(wěn)定性，降低內(nèi)肽酶的酶促降解，而且對(duì)于多肽的空間結(jié)構(gòu)也產(chǎn)生極為關(guān)鍵的作用。通過(guò)N-甲基化，受影響的酰胺鍵不再成為H-鍵供體，這將對(duì)多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響深遠(yuǎn)。N-甲基化也因此成為即Alanine scan, D-amino acid scan之后，最常為藥物化學(xué)家使用的多肽篩選工具。

       著名的N-甲基化多肽上市藥物，包括環(huán)孢素cyclosporine A（圖5）等，其結(jié)構(gòu)中包含7個(gè)N-甲基氨基酸，不僅大大提高了環(huán)孢素的水解穩(wěn)定性，也為它的空間結(jié)構(gòu)形成了幾乎無(wú)法復(fù)制的精妙調(diào)節(jié)，使得環(huán)孢素成為第一款實(shí)現(xiàn)口服遞送的多肽藥物。

       圖5. Cyclosporine A化學(xué)結(jié)構(gòu)

       05

       脂化修飾

       脂化修飾（lipidation）通?？梢詼p少一個(gè)多肽的正電荷（被修飾的氨基酸通常是賴氨酸）。但更關(guān)鍵的是，引入的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)大大增加了多肽的半衰期，這通常被認(rèn)為是通過(guò)增加與白蛋白（albumin）的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。

       在這方面最著名的例子來(lái)自于GLP-1多肽類(lèi)似物，治療2型糖尿病和肥胖癥的司美格魯肽，以及同為2型糖尿病多肽藥物的GLP-1/GIP受體雙重激動(dòng)劑替爾泊肽（圖6）。司美格魯肽更是在使用滲透增強(qiáng)劑（permeation enhancer）SNAC的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了口服制劑（Rybelsus?）的開(kāi)發(fā)與上市。

       關(guān)于脂化修飾這塊內(nèi)容，哥哈骎老師之前的文章中也有詳細(xì)闡述，文章傳送門(mén)：“當(dāng)紅炸子雞”司美格魯肽、替爾泊肽的背后，脂質(zhì)化修飾助力多肽藥物口服遞送。

       圖6. 脂化多肽司美格魯肽與替爾泊肽化學(xué)結(jié)構(gòu)

       06

       細(xì)胞遞送多肽

       雖然絕大多數(shù)多肽靶向細(xì)胞外蛋白，但為了到達(dá)細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)受體，多肽需要穿過(guò)細(xì)胞膜。然而，肽通常只能有限地穿越這種生物屏障。為了定制用于細(xì)胞內(nèi)遞送的肽，與細(xì)胞穿透肽（CPPs, Cell-Penetrating Peptides）序列的綴合，使得將生物活性肽遞送至細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)成為了可能。研究中使用了幾種細(xì)胞穿透肽，例如penetratin、聚精氨酸、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和TAT (trans-activator of transcription, 轉(zhuǎn)錄反式激活因子) 肽[3]。

       07

       分子接枝 (Molecular grafting)

       圖7. 多肽分子接枝示意圖，來(lái)源：Drug Discovery Today

       分子接枝是多肽藥物開(kāi)發(fā)和新型探針設(shè)計(jì)的一個(gè)有前途的趨勢(shì)。該方法用于設(shè)計(jì)具有類(lèi)藥物特性的肽療法。構(gòu)象受限和高度穩(wěn)定的肽在這個(gè)策略中被用作支架，與生物活性表位“融合”，產(chǎn)生所謂的分子接枝[4]。在合成探針并驗(yàn)證其構(gòu)象完整性后，根據(jù)其生物活性選擇接枝肽。所得分子結(jié)合了肽支架提供的穩(wěn)定性增加、以及生物活性表位提供的功能化的優(yōu)點(diǎn)。

       研發(fā)人員已針對(duì)此應(yīng)用探索了幾種自然衍生的肽，包括環(huán)狀半胱氨酸結(jié)肽（knot peptide）[5]、套索肽（lasso peptide）[6]、環(huán)狀向日葵胰蛋白酶抑制劑1[7]和θ-防御素[8]。該方法用于制備靶向GPCR、整合素、離子通道和其他細(xì)胞表面受體的新探針，包括血管內(nèi)皮 生長(zhǎng)因子受體 (VEGFR)、 酶或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。

       線性抗血管生成肽P15，在人血清中2小時(shí)內(nèi)分解。如果使用分子接枝策略，將P15序列整合到主鏈環(huán)化胰蛋白酶抑制肽——Momordica cochinchinensis胰蛋白酶抑制劑-II (MCoTI-II) 中，不僅顯著提高P15穩(wěn)定性至8h，而且改善了對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞遷移的抑制特性[9]。

       人血小板反應(yīng)蛋白-1（TSP1）是血管生成的內(nèi)源性抑制劑。來(lái)自血小板反應(yīng)蛋白序列的生物活性七肽，通過(guò)與清道夫受體CD36相互作用抑制血管生成。然而，TSP1在人血清中會(huì)在4小時(shí)內(nèi)降解。在MCoTI-II或向日葵胰蛋白酶抑制劑1支架中“嫁接”生物活性七肽，不僅顯著提高了肽在24小時(shí)內(nèi)的穩(wěn)定性，而且還增加了其抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞遷移的活性[10]。

       分子接枝技術(shù)將豐富多肽藥物開(kāi)發(fā)的可使用工具，利用這種方法有可能在未來(lái)開(kāi)發(fā)出更多有價(jià)值的多肽藥物。