佐劑一詞源自拉丁語單詞ad和juvare，意思是“幫助”。佐劑的作用是幫助引導共同給藥的疫苗抗原產生保護所需的免疫反應。由于對其作用機制的了解不足，新的佐劑開發(fā)一直舉步不前。最近，Toll樣受體（TLRs）的發(fā)現(xiàn)徹底改變了這一領域，TLRs是一種先天免疫受體，直接或間接負責檢測病原體相關分子模式（PAMP），并通過激活先天和適應性免疫途徑對其作出反應。

       天然存在和合成的TLR激動劑可以利用這些內源性免疫信號通路來增強和調節(jié)疫苗反應，從而使其成為優(yōu)良的疫苗佐劑。這不僅對開發(fā)針對傳染病的疫苗具有重要意義，而且對針對癌癥、過敏、阿爾茨海默病和其他疾病的免疫療法也具有重要意義。每種TLR都有自己的特定組織定位和下游基因信號通路，TLR激動劑可以與其他TLR或替代佐劑組合，以產生具有協(xié)同或調節(jié)作用的組合佐劑，這為研究人員提供了精確定制具有特定免疫效果的佐劑的機會。

       TLR受體家族

       TLR受體家族包含六種跨膜TLR（TLR-1、2、4、5、6和10）和四種定位于內涵體膜的TLR（TLC-3、7、8和9）。每種PAMP都被不同的TLR識別，即脂多糖（TLR4）、脂肽（TLR2與TLR6或TLR1）、鞭毛蛋白（TLR5）、單鏈RNA（TLR7/8）、雙鏈RNA（TLR3）和含CpG基序的DNA（TLR9）。

       在遇到特定的PAMP時，TLRs形成同源二聚體（TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8和TLR9）或異二聚體（TLC1/2或TLR2/6）。配體誘導的TLRs二聚化使得銜接蛋白（MYD88）能夠結合到TIR結構域。TLR3比較特別，該蛋白作為TLRs的通用銜接蛋白，利用含有TIR結構域的誘導干擾素-β蛋白（TRIF）作為適配器蛋白。TLR受體和銜接蛋白的多樣性意味著TLR可以參與啟動許多不同的下游免疫途徑。

       TLR信號傳導及其在免疫偏向中的作用

       TLRs的激活可以調節(jié)疫苗產生的免疫反應類型。反應類型由特定TLR及其銜接蛋白激活的信號通路決定。一般來說，大多數TLR途徑導致Th1免疫反應，但TLR2除外，可能由于TLR2配體的多樣性，TLR2可以誘導促炎和抗炎途徑，導致Th1、Th0或Th2免疫反應。

       除TLR3外，大多數TLR通過MyD88發(fā)揮作用。TLR激活后，MyD88募集由IL1受體相關激酶（IRAK）1、IRAK2和IRAK 4組成的寡聚復合物，并激活MyD88 TNF受體相關因子6（TRAF6）?；罨腡RAF6隨后觸發(fā)核因子κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑，從而誘導促炎細胞因子，如IL-12和TNF-α。TLR7和TLR9可以激活TRAF3磷酸化干擾素調節(jié)因子7（IRF7），從而產生IFN-α。此外，TLR3和TLR4已被證明通過其TRIF銜接蛋白募集TRAF3來誘導IFN-β的產生，從而激活IRF3。I型IFN應答可誘導強Th1細胞/細胞毒性T細胞（CTL）應答，該應答對鑒定和清除感染或癌細胞很重要。TLR2受體主要誘導以高IL-10產生和低IL-12為特征的強Th2免疫反應。

       TLR并不專門觸發(fā)Th1或Th2途徑，而是可以影響多種途徑。正是信號事件的平衡決定了免疫偏向。例如，一項研究表明，TLR4和TLR2激動劑的激活可以通過p38 MAPK和ERK1/2-FOS途徑刺激信號傳導，分別導致IL-12或IL-10的產生；然而，TLR4在比TLR2更高的閾值下誘導p38 MAPK信號傳導，而TLR2在比TLR4更高的閾下誘導ERK1/2信號傳導，導致免疫極化。

       TLRs在適應性免疫中的作用

       TLRs協(xié)調了從免疫細胞遷移到增強抗體親和力成熟的許多功能。TLRs作為危險信號傳感器，增加了免疫細胞向疫苗給藥部位的運輸。TLR參與可增強I類和II類MHC分子的抗原捕獲、處理和呈遞。某些特定類型的TLR可以不同程度地影響抗原的交叉呈遞，從而TLR3或TLR4，而不是TLR2或TLR7/8配體，減少CD8 +T細胞對抗原的攝取和交叉呈遞。TLR激活也可導致共刺激分子（如CD80和CD86）的上調，這對APC啟動幼稚T細胞至關重要。DC細胞的TLR在自我/非自我抗原識別以及是產生免疫反應還是免疫耐受中起著關鍵作用。不同類型的APC表達不同的TLR，例如髓系DC表達TLR2和TLR4，而漿細胞樣DC（pDC）表達TRL7和TLR9。因此，TLR對不同DC譜系的優(yōu)先激活可以影響隨后的免疫偏向。

       與小鼠相比，TLR在B細胞上的表達在人類中更為有限，人類主要表達TLR 2、7、9、10，TLR2配體需要通過B細胞受體（BCR）和TLR7的交聯(lián)進行額外增敏，TLR7需要1型干擾素（IFN）引發(fā)。這些TLR激動劑在體外誘導B細胞的增殖、活化和分化。最初，人們認為TLRs只促進B細胞的卵泡外反應，其特征是快速產生低親和力抗體；然而，最近的研究表明，TLRs也可以增強生發(fā)中心反應，從而產生高親和力抗體。TLR與BCR協(xié)同作用，誘導類轉換重組和抗體反應的成熟。TLR4還增強了B細胞向引流淋巴結的遷移，并在此過程中加快了抗體類別的轉換。不適宜的B細胞TLR信號傳導與自身反應性B細胞和自身免疫性疾病的產生有關；因此，在疫苗配方中避免過度的TLR刺激非常重要。

       TLR也已被證明能增強各種不同的T細胞亞群。幾項研究表明，TLRs可以作為CD8+T細胞的共刺激分子，促進細胞增殖/存活、效應器功能、細胞因子產生和記憶形成的增加。TLRs在Treg細胞中的作用仍然存在爭議。幾項研究表明，TLR2激動劑可誘導Treg抑制活性的暫時喪失；而其他研究表明，盡管TLR2激動劑可增加抗原特異性增殖，但Treg細胞仍保留其抑制功能。

       TLR佐劑的最新研究進展

       疫苗配方中使用的TLR激動劑有多種形式，從脂肽到單鏈DNA和RNA。下面介紹TLR佐劑的主要類別。

       TLR2

       TLR2在多種細胞表面表達，包括單核細胞、巨噬細胞、內皮細胞、上皮細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞、髓系抑制細胞、血小板和肥大細胞。TLR2識別的PAMP庫是最廣泛的，因為它能夠與TLR1和TLR6（以及人類中的TLR10）形成異二聚體。

       TLR2佐劑的范圍很廣，包括合成脂肽（PAM3CSK4和PAM2CSK4）、阿拉伯甘露糖脂、脂磷壁酸、GPI膜錨定物、酵母多糖和肽聚糖。近年來TLR2研究的主要趨勢包括發(fā)現(xiàn)小型合成TLR2激動劑、改進傳統(tǒng)TLR2激動物的特性以及TLR2與疫苗抗原的生物偶聯(lián)。例如，XS15（PAM3CS-GDPKHPKSF）是一種新的基于PAM3CS的TLR-1/2激動劑，其中PAM3CSK4的四賴氨酸（K4）被九肽（GDPKHPKSF）取代，以改變偶聯(lián)物的水溶性，不僅促進攝取，而且易于純化。使用TLR2激動劑作為佐劑的局限性包括大多數配體的大小、復雜性和疏水性。

       TLR3

       TLR3是一種細胞內識別系統(tǒng)，對病毒核酸（dsRNA、ssRNA和ssDNA）以及內源性雙鏈RNA作出反應。已經開發(fā)了許多TLR3激動劑，如RGC100和ARNAX，一種合成的DNA-RNA雜交化合物。然而，在過去兩年中，研究人員又回到了使用傳統(tǒng)的dsRNA模擬配體，如poly IC，重點是改進其遞送模式和新的疾病應用。

       TLR4

       TLR4是TLR家族中研究最多的成員，它識別脂多糖（LPS）。TLR4位于質膜上，主要在髓系細胞上表達，而pDCs和幼稚B細胞不表達。TLR4通過其共受體骨髓分化因子-2（MD-2）和CD14識別LPS。最近關于TLR4激動劑的工作集中在修飾產物的開發(fā)和評估上，如單磷酸脂質A（MPLA）和吡喃葡萄糖脂質A（GLA），它們在結構上與LPS相關，但沒有高致熱原性并保持強免疫增強特性，從而增加了其臨床應用的可行性。

       TLR5

       TLR5識別鞭毛蛋白，并在上皮細胞和免疫細胞（如巨噬細胞和未成熟DC）上表達，通過MyD88依賴性信號通路產生免疫反應。最近關于TLR5激動劑的工作主要集中在提高耐受性上。不幸的是，鞭毛蛋白會誘導不必要的過度反應原性，作為一種蛋白質，它可以誘導針對自身的抗體，干擾其作為佐劑的功能。有研究通過從鞭毛蛋白中去除B細胞表位區(qū)域解決了這一問題，脫免疫的鞭毛蛋白保留了其TLR5佐劑活性。

       TLR7/8

       TLR7和TLR8位于免疫細胞的內涵體膜上。TLR7主要在pDC和B細胞中表達，而TLR8在髓系樹突狀細胞、單核細胞中表達，在pDC中表達程度較低。TLR7/8識別單鏈核糖核酸（ssRNA），并通過MyD88依賴性途徑發(fā)出信號。在天然配體中，富含腺苷和尿苷的寡核苷酸（ORN）能夠激活TLR8，而對TLR7沒有任何影響，而富含鳥苷的ORN激活TLR7和TLR8依賴性信號傳導。TLR7以單體形式存在，并在配體存在下二聚，而TLR8以天然存在的弱二聚體存在，在配體結合時發(fā)生構象變化。目前已發(fā)現(xiàn)15種以上的新型雜環(huán)分子，如咪唑喹啉、蝶呤、嘧啶、吡啶嘧啶、吡 咯 嘧啶和苯并咪唑，被鑒定為TLR7/8激動劑。

       TLR7/8激動劑的一個常見缺點是反應原性，近年來，有大量研究試圖克服這些副作用。將TLR7/8激動劑封裝在基于陽離子DOEPC的脂質體制劑納米顆粒中，或將這些小分子共價連接到超支化聚合物上，可以避免其有害的系統(tǒng)反應，同時保持其對體液免疫的影響。

       TLR9

       TLR9在細胞內定位于內涵體膜中，識別細菌和病毒DNA的單鏈非甲基化CpG寡核苷酸。TLR9在免疫細胞上表達，如樹突狀細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞和其他APC。合成CpG序列可用作TLR9激動劑，以增強疫苗的免疫反應，并且每種獨特的序列變異組合已被證明具有不同的結構和生物學特性。

       TLR9激動劑在過去兩年中的最新發(fā)展主要集中在CpG向細胞的有效遞送和攝取上。例如，一項研究介紹了一種將CpG-ODN偶聯(lián)到新型陽離子脂質體上的新方法，該復合物能夠在低抗原和佐劑劑量下誘導強烈的免疫反應。

       組合TLR佐劑

       將不同TLR的激動劑組合在單一疫苗中產生協(xié)同效應，可以驅動強大的疫苗免疫反應。例如，包含1V270（TLR7激動劑）和2B182C（TLR4激動劑）的脂質體佐劑誘導了針對流感的平衡的抗HA和抗NA IgG1和IgG2a反應，而沒有Th1促炎反應常見的過度反應原性。類似地，一項研究評估了卵清蛋白（OVA）與兩到三種TLR配體的十種獨特組合的共包封，包括Pam3CSK4（TLR2激動劑）、MPLA（TLR4激動劑），咪喹莫特（TLR7/8激動劑）和CpG（TLR9激動劑），而三重組合以總體平衡的Th1/Th2應答促進抗原特異性抗體滴度。因此，TLR佐劑的組合可以提供廣泛的定制免疫反應。

       TLR激動劑與其他PAMP如NOD2和巨噬細胞誘導型Ca2的組合?-依賴性凝集素受體（Mincle）配體也很有前景。共價連接CL239（TLR7激動劑）和胞壁酰二肽（NOD2激動劑），并將雙激動劑作為納米顆粒與NP-p24 HIV疫苗結合，協(xié)同作用增強了對小鼠的保護。

       小結

       TLR激動劑利用內源性先天免疫途徑增強疫苗適應性免疫反應。在過去兩年中，佐劑領域一直被新冠肺炎疫苗的研究所主導。這一流行病的推動力迅速推動了佐劑領域的發(fā)展，多種新佐劑現(xiàn)已被納入許可的新冠肺炎新疫苗中。除了新冠肺炎，對更有效佐劑的需求繼續(xù)增長，特別是在癌癥和瘧疾、結核病和艾滋病毒等難以預防的傳染病領域。解開TLR聯(lián)合佐劑背后的作用機制，再加上更多的安全性和有效性研究數據，有助于推動下一代佐劑平臺的發(fā)展。