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CPHI制藥在線 資訊 清華大學(xué)陳春來/劉俊杰團隊揭示CasX靶標(biāo)搜索和切割過程的動態(tài)調(diào)控機制

清華大學(xué)陳春來/劉俊杰團隊揭示CasX靶標(biāo)搜索和切割過程的動態(tài)調(diào)控機制

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作者：BW  來源：生物世界
  2024-07-15
CRISPR-Cas系統(tǒng)是細菌和古菌中對抗外源核酸入侵的獲得性免疫系統(tǒng)?；贑RISPR-Cas系統(tǒng)在RNA引導(dǎo)下靶向DNA的功能，已經(jīng)開發(fā)了多種被廣泛使用的基因編輯和調(diào)控工具。

       CRISPR-Cas系統(tǒng)是細菌和古菌中對抗外源核酸入侵的獲得性免疫系統(tǒng)?；贑RISPR-Cas系統(tǒng)在RNA引導(dǎo)下靶向DNA的功能，已經(jīng)開發(fā)了多種被廣泛使用的基因編輯和調(diào)控工具。

       CasX（又稱Cas12e）屬于第2類CRISPR-Cas系統(tǒng)，因其體積較小，相較于廣泛使用的Cas9和Cas12a蛋白更便于遞送到細胞內(nèi)，展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。但除了共有的RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域外，CasX與Cas12a和Cas9在蛋白序列上相似性甚微。此外，CasX獨有的NTSB結(jié)構(gòu)域，對于其切割活性至關(guān)重要。這些不同之處暗示了CasX可能具有獨特的靶向和切割機制。

       2024年7月12日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心陳春來課題組與劉俊杰課題組合作，在 Nucleic Acids Research 期刊發(fā)表了題為：Conformational dynamics of CasX (Cas12e) in mediating DNA cleavage revealed by single-molecule FRET 的研究論文。

       該論文細致表征了CasX從非特異性結(jié)合到找到靶點并完成切割的動態(tài)過程，揭示了其獨特的機制。

Conformational dynamics of CasX (Cas12e) in mediating DNA cleavage revealed by single-molecule FRET 研究論文

       利用供體（Cy3）標(biāo)記的sgRNA和受體（Cy5）標(biāo)記的DNA，研究者通過單分子FRET實驗捕捉到CasX蛋白在切割過程中依次呈現(xiàn)的3種構(gòu)象狀態(tài)：R-loop起始狀態(tài)、R-loop形成后非靶標(biāo)鏈（NTS）切割狀態(tài)和靶標(biāo)鏈（TS）切割狀態(tài)（圖1）。此外，還定量分析了sgRNA與DNA的匹配度如何影響CasX在DNA上的穩(wěn)定性和切割活性，為基于CasX的基因編輯和調(diào)控工具的設(shè)計提供了重要依據(jù)。DpbCasX和PlmCasX在切割特異性上的差異，源于它們在結(jié)合DNA及切割過程中的動力學(xué)差異；而兩者在切割過程中FRET模式的不同，則歸因于它們在DNA上切割位點的差異。

DpbCasX結(jié)合及切割全匹配DNA的構(gòu)象動態(tài)

圖1. DpbCasX結(jié)合及切割全匹配DNA的構(gòu)象動態(tài)

       在本文中，研究者還提出了“有效靶標(biāo)搜索效率”這一新的概念，用以衡量Cas蛋白在接觸靶標(biāo)后的有效識別效率。數(shù)據(jù)顯示，CasX的有效靶標(biāo)搜索效率（僅10%）遠低于Cas9和Cas12a（50%-80%）。這意味著，CasX需要嘗試約10次才能成功識別靶標(biāo)位點，細胞內(nèi)復(fù)雜環(huán)境可能進一步降低其搜索效率，從而導(dǎo)致其在細胞內(nèi)較低的編輯活性。這一發(fā)現(xiàn)為未來優(yōu)化CasX以及其他Cas蛋白提供了新視角。
       最后，研究者構(gòu)建了CasX識別與切割DNA的動態(tài)模型（圖2）。CasX在搜尋靶點時與DNA短暫非特異性結(jié)合（Nonspecific binding），在動態(tài)搜索過程中識別PAM序列（PAM recognition），開始形成R-loop結(jié)構(gòu)（R-loop initiation），然而，相較于SpCas9、AsCas12a和LbCas12a， CasX在這一步的效率低5-8倍。識別PAM后，CasX依賴充足的PAM近端匹配驅(qū)動R-loop形成，并利用單一的RuvC結(jié)構(gòu)域活性中心依次切割NTS和TS（R-loop formation and NTS cleavage，TS cleavage），最后釋放切割產(chǎn)物（DNA fragment release）。CasX獨特的NTSB結(jié)構(gòu)域在DNA解旋和R-loop形成中發(fā)揮了重要功能。這一動態(tài)模型深化了我們對CasX工作機制的理解，并為CasX以及其他Cas蛋白的優(yōu)化和改造提出了新的思路和策略。
      
CasX結(jié)合和切割DNA的動態(tài)模型

圖2. CasX結(jié)合和切割DNA的動態(tài)模型

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