Nature Cancer：趙蔚/李杰團(tuán)隊(duì)揭示磷酸化HDAC6的相分離導(dǎo)致三陰性乳腺癌染色質(zhì)異常，并提出治療策略

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2024-08-29

三陰性乳腺癌（TNBC）是一種高度異質(zhì)性的疾病，展現(xiàn)出極高的侵襲性，常規(guī)的內(nèi)分泌治療或化療對(duì)此類癌癥通常無(wú)效。

三陰性乳腺癌（TNBC）是一種高度異質(zhì)性的疾病，展現(xiàn)出極高的侵襲性，常規(guī)的內(nèi)分泌治療或化療對(duì)此類癌癥通常無(wú)效。之前的研究表明TNBC缺乏有效的生物標(biāo)志物來(lái)指導(dǎo)治療決策和預(yù)測(cè)治療反應(yīng)，因此從新的角度理解TNBC病理生物學(xué)特性尤為重要。

三維染色質(zhì)結(jié)構(gòu)指的是染色質(zhì)在細(xì)胞核中的空間排列，包括染色質(zhì)區(qū)域如何折疊、聚集以及它們?nèi)绾闻c核小體和其他核內(nèi)結(jié)構(gòu)相互作用。在腫瘤中，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的異常重組可能導(dǎo)致染色質(zhì)可及性變化，進(jìn)而激活原本靜默的致癌基因，或抑制抑癌基因表達(dá)；染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變也可以通過(guò)影響染色體表觀遺傳標(biāo)記從而調(diào)控基因的表達(dá)。然而，盡管三維染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)腫瘤表型的影響非常關(guān)鍵，但TNBC三維基因組的調(diào)控機(jī)制仍知之甚少。

2024年8月28日，廣東省人民醫(yī)院、中山大學(xué)、廣州市婦女兒童中心、桂林醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院及順德醫(yī)院的聯(lián)合科研團(tuán)隊(duì)，以趙蔚和李杰兩位教授為通訊作者，在 Nature Cancer 期刊發(fā)表了題為：Phase separation of phospho-HDAC6 drives aberrant chromatin architecture in triple-negative breast cancer 的研究論文。

該研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化形式的HDAC6蛋白在三陰性乳腺癌（TNBC）細(xì)胞的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域形成了液-液相分離（LLPS）凝聚體，而在非TNBC中這種現(xiàn)象較少見。研究還鑒定出Nexturastat A作為磷酸化HDAC6 LLPS抑制劑，能夠?qū)е氯旧|(zhì)結(jié)構(gòu)重塑和轉(zhuǎn)錄譜改變，有效抑制TNBC的腫瘤生長(zhǎng)。該研究首次揭示了TNBC中存在磷酸化形式的HDAC6蛋白，提出了通過(guò)干預(yù)磷酸化HDAC6的相分離治療TNBC的新策略。

該研究顯示，與非TNBC及相鄰非癌組織相比，TNBC中HDAC6在細(xì)胞核表達(dá)顯著增加，且主要以磷酸化形式存在。通過(guò)對(duì)HDAC6的潛在磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行突變分析，發(fā)現(xiàn)特定位點(diǎn)Ser 22的磷酸化對(duì)其核內(nèi)定位至關(guān)重要，這種磷酸化狀態(tài)與腫瘤的分期及轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，并與患者的總生存期負(fù)相關(guān)。超分辨率顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，TNBC細(xì)胞中磷酸化HDAC6傾向于在細(xì)胞核中形成LLPS的凝聚體，這些凝聚體主要分布在活躍的染色質(zhì)區(qū)域，并與轉(zhuǎn)錄活躍相關(guān)的標(biāo)記物共定位。此外，該研究還觀察到表皮生長(zhǎng)因子（EGF）能通過(guò)特定的激酶GRK2顯著增加磷酸化HDAC6的水平和凝聚體形成。

接下來(lái)，研究團(tuán)隊(duì)探討了HDAC6的兩個(gè)主要固有無(wú)序區(qū)域（IDRs）在相分離作用。研究發(fā)現(xiàn)，HDAC6的第一個(gè)無(wú)序區(qū)域（IDR1）的刪除顯著減少了磷酸化HDAC6的相分離，而第二個(gè)無(wú)序區(qū)域（IDR2）的刪除則對(duì)相分離沒有顯著影響。此外，IDR1內(nèi)Ser 22位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)對(duì)其相分離能力有重要影響。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，HDAC6的特定結(jié)構(gòu)域，如核輸出信號(hào)（NES）域的刪除，顯著增強(qiáng)了HDAC6在核內(nèi)的定位和相分離能力。

探究腫瘤中異常LLPS凝聚體形成的機(jī)制不僅有助于理解染色質(zhì)結(jié)構(gòu)在基因表達(dá)調(diào)控中的角色，而且可能為開發(fā)新的治療策略提供線索。例如，NUP98-HOXA9的LLPS有助于形成廣泛的超級(jí)增強(qiáng)子（SE）樣結(jié)合模式，從而促進(jìn)白血病基因的轉(zhuǎn)錄激活。此外，趙蔚團(tuán)隊(duì)之前的研究發(fā)現(xiàn)，HOXB8和FOSL1在染色質(zhì)的SE位點(diǎn)形成的LLPS導(dǎo)致了骨肉瘤中轉(zhuǎn)錄的失調(diào)。盡管LLPS在癌癥中具有重要作用，但如何特異性破壞癌癥中LLPS凝聚體仍有待探索。

研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)基于相分離蛋白的篩選，發(fā)現(xiàn)了一種名為Nexturastat A的HDAC6抑制劑，該抑制劑能有效地抑制TNBC中磷酸化HDAC6凝聚體的形成。相比之下，另一種HDAC6抑制劑HPOB則未能達(dá)到相同的效果。實(shí)驗(yàn)表明，Nexturastat A通過(guò)降低磷酸化HDAC6的LLPS，從而抑制TNBC細(xì)胞的增殖、瘤球形成能力和侵襲性，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Nexturastat A在體內(nèi)顯著抑制了TNBC的生長(zhǎng)。此外，Nexturastat A顯示出極低的非癌細(xì)胞毒性，表明其具有良好的安全性。

Nexturastat A能夠顯著改變HDAC6與其相互作用蛋白之間的互作，尤其是降低與14-3-3θ的結(jié)合，后者是已知的LLPS的潛在參與因子。Nexturastat A的處理還減少了磷酸化HDAC6與進(jìn)出核運(yùn)輸?shù)鞍譏mportin β的相互作用，這一過(guò)程依賴于HDAC6的S22位點(diǎn)。此外，研究還揭示了NUP153在磷酸化HDAC6進(jìn)入細(xì)胞核過(guò)程中的關(guān)鍵作用。

隨后，研究團(tuán)隊(duì)詳細(xì)探討了Nexturastat A對(duì)TNBC染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響。通過(guò)Hi-C分析發(fā)現(xiàn)，Nexturastat A處理后，TNBC細(xì)胞的全基因組染色質(zhì)相互作用發(fā)生了顯著變化，特別是在開放和封閉染色質(zhì)區(qū)域的重新分布。此外，Nexturastat A的治療還促進(jìn)了新的染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，這些新環(huán)結(jié)構(gòu)富含RNA聚合酶II（Pol II）特異性DNA結(jié)合和免疫系統(tǒng)過(guò)程通路，顯示出Nexturastat A對(duì)染色質(zhì)動(dòng)態(tài)具有重要的影響。

通過(guò)對(duì)Nexturastat A處理的TNBC細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq和Pol II ChIP-seq分析，揭示了Nexturastat A處理主要導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化和轉(zhuǎn)錄模式的重新編程，這體現(xiàn)在染色質(zhì)的增加可及性和Pol II的增加結(jié)合。此外，通過(guò)ATAC-seq研究發(fā)現(xiàn)Nexturastat A處理能夠促使腫瘤抑制基因的表達(dá)上調(diào)，原癌基因表達(dá)下調(diào)，并且激活了與免疫反應(yīng)相關(guān)的基因。

最后，Nexturastat A通過(guò)改變HDAC6的結(jié)合模式和H3全乙?；揎棧@著影響了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，尤其是在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）周圍。特別地，研究團(tuán)隊(duì)識(shí)別出一組基因顯示HDAC6結(jié)合和H3全乙?；囊恢伦兓@些基因主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和TP53信號(hào)通路中，包括腫瘤抑制基因ATF3。此外，ATF3敲減實(shí)驗(yàn)表明，ATF3是HDAC6的一個(gè)重要下游靶標(biāo)，其敲減降低了細(xì)胞對(duì)Nexturastat A治療的敏感性，影響了細(xì)胞的生存和侵襲能力。

綜上，該研究揭示了磷酸化HDAC6在TNBC中的全新作用，特別是它在轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域形成的相分離凝聚體對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響。通過(guò)與14-3-3θ共凝聚，磷酸化HDAC6不僅改變了染色質(zhì)的物理結(jié)構(gòu)，還促進(jìn)了特定的組蛋白乙?；揎椇娃D(zhuǎn)錄譜的重編程，從而推動(dòng)了TNBC的惡性表型發(fā)展。這一發(fā)現(xiàn)不僅為我們提供了對(duì)TNBC中染色質(zhì)動(dòng)態(tài)復(fù)雜性的更深層理解，還可能指明了新的治療策略，即通過(guò)調(diào)控磷酸化HDAC6來(lái)干預(yù)TNBC的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞命運(yùn)。