2019年12月18日，密切圍繞"國家藥品安全十三五規(guī)劃"的總體目標，以建立"最嚴謹?shù)臉藴?quot;為準則，對標國際先進標準，國家藥典委員會官網(wǎng)發(fā)布2322《汞、砷元素形態(tài)及其價態(tài)測定法》（第三次征求意見稿），公示期為一個月，對中藥行業(yè)具有深遠的意義，由于中藥成分的復雜性，現(xiàn)行標準難以全面評價藥品質量并發(fā)現(xiàn)潛在的質量問題，本文為大家梳理了汞、砷元素形態(tài)及其價態(tài)測定法相關知識點。

       一、中藥材汞、砷元素形態(tài)及其價態(tài)測定法現(xiàn)狀

       在中藥材重金屬及有害元素殘留控制方面，目前大多數(shù)國家藥典主要制定了汞、砷等殘留標準，2015版《中國藥典》在技術上實現(xiàn)了多種重金屬有害元素同時檢測，還首次針對重金屬在不同價態(tài)表現(xiàn)出不同的藥理和**作用的特點，探索制定了汞和砷元素形態(tài)及其價態(tài)測定法，可以說在重金屬及有害元素檢測水平上開始借鑒國際先進經(jīng)驗和科學理念，更加注重與國際藥品通用性技術標準的統(tǒng)一協(xié)調(diào)。

       二、三版本《汞、砷元素形態(tài)及其價態(tài)測定法》對照看

       按照《中國藥典》2020年版編制工作進度安排，2322《汞、砷元素形態(tài)及其價態(tài)測定法》第一、二、三次征求意見稿已分別于2018年11月、2019年5月、2019年12月在國家藥典委員會官網(wǎng)面向社會各界公開征求意見，針對重金屬在不同價態(tài)表現(xiàn)出不同的藥理和**作用的特點，逐漸修訂完善了汞和砷元素形態(tài)及其價態(tài)測定法，可以說在重金屬及有害元素檢測水平上，經(jīng)過修訂和完善，我國2020年版藥典可達到國際先進的水平。

       紅色字體標注的為第一次征求意見稿修訂內(nèi)容。

       淡橙色底紋標注的為第二次征求意見稿修訂內(nèi)容。

       淡藍色底紋標注的為第三次征求意見稿修訂內(nèi)容。

       2322   汞和、砷元素形態(tài)及其價態(tài)測定法

       本法系采用高效液相色譜-電感耦合等離子質譜法測定供試品中汞或、砷元素形態(tài)及其價態(tài)。

       由于元素形態(tài)及其價態(tài)分析的前處理方法與樣品密切相關，供試品溶液的制備方法如有特殊要求應在品種項下進另行規(guī)定。

       一、汞元素形態(tài)及其價態(tài)測定法

       照高效液相色譜法-電感耦合等離子體質譜測定法（通則0412）測定。

       色譜、質譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（150mm×4.6mm，5µm）；以甲醇-0.01mol/L乙酸銨溶液（含0.12%L-半胱氨酸，氨水調(diào)節(jié)pH值至7.5）（8:92）為流動相；流速為1.0ml/min。以具同軸霧化器和碰撞反應池的電感耦合等離子體質譜（具碰撞反應池）進行檢測；測定時選取同位素為²⁰²Hg，根據(jù)干擾情況選擇正常模式或碰撞池反應模式。3種不同形態(tài)汞及不同價態(tài)汞的分離度應大于1.5（圖1）。

       圖 1 汞元素形態(tài)及價態(tài)示意圖測定圖譜

       1.氯 化 汞（二價汞）；2.甲基汞；3.乙基汞

       對照品貯備溶液的制備 分別取氯 化 汞、甲基汞、乙基汞對照品適量，精密稱定，再精密吸取汞元素標準溶液（1mg/ml，介質類型為硝酸）適量，加 8％甲醇制成每1ml各含100ng（均以汞計）的溶液，即得。

       標準曲線溶液的制備 精密吸取對照品貯備液適量，加8％甲醇分別制成每1ml各含0.5ng、1ng、5ng、10ng、20ng（均以汞計）系列濃度的溶液，即得。

       供試品溶液的制備 （1）礦物藥及其制劑：除另有規(guī)定外，取供試品適量，取相當于含汞量20～30mg的供試品粉末（過四號篩），精密稱定，精密加入人工胃液或人工腸液適量，置37℃水浴中超聲處理適當時間，搖勻，取適量，靜置約2420～36小時，吸取中層溶液適量，用微孔濾膜（10μm）濾過，精密量取續(xù)濾液適量，用0.125mol/L鹽酸溶液稀釋至一定體積，搖勻，即得。同法制備空白溶液。

       （2）動、植物類中藥（除甲類、毛發(fā)類）：除另有規(guī)定外，取供試品粉末（過三號篩）0.2～0.5g，精密稱定，加0.1mol/L硝酸銀溶液200～600μl，精密加入硝酸人工胃液適量，置37～45℃水浴中加熱約20～24小時，取出，搖勻，室溫放置2小時，取上清液，用一次性雙層濾膜（10μm+3μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。同法制備空白溶液。

       測定法 分別吸取系列標準曲線溶液和供試品溶液各20～100μl，注入液相色譜儀，測定。以系列標準曲線溶液中不同形態(tài)汞或不同價態(tài)汞的峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算供試品溶液中不同形態(tài)或不同價態(tài)汞的含量，即得。

       二、砷元素形態(tài)及其價態(tài)測定法

       照高效液相色譜法-電感耦合等離子體質譜測定法（通則0412）測定。

       色譜、質譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物載體鍵合三甲基銨陰離子交換材料或相當?shù)牟牧蠟樘畛鋭?50×4.1mm；10µm）；以0.025mol/L磷酸二氫銨溶液（氨水調(diào)節(jié)pH值至8.0）為流動相A，以水為流動相B，按下表進行梯度洗脫；流速為1.0ml/min。以具同軸霧化器和碰撞反應池的電感耦合等離子體質譜進行檢測；測定時選取同位素為⁷⁵As，選擇碰撞池反應模式或根據(jù)不同儀器的要求選用適宜校正方程進行校正。

       6 種不同形態(tài)砷的分離度應符合要求，其中砷膽堿、砷甜菜堿和亞砷酸的分離度應不小于1.0（圖2）。

       圖 2 砷元素形態(tài)及價態(tài)示意圖測定圖譜

       1.砷膽堿；2.砷甜菜堿；3.亞砷酸（三價砷）

       4.二甲基砷；5.一甲基砷；6.砷酸（五價砷）

       對照品貯備溶液的制備 分別取亞砷酸、砷酸、一甲基砷、二甲基砷、砷膽堿、砷甜菜堿對照品適量，精密稱定，加水制成每 1ml各含 2.0μg（均以砷計）的對照品溶液，即得。

       標準曲線溶液的制備 精密吸取對照品貯備溶液適量，加0.02mol/L乙二胺四醋酸二鈉溶液制成每1ml各含1ng、5ng、20ng、50ng、100ng、200ng、500ng（均以砷計）系列濃度的溶液，搖勻，即得。

       供試品溶液的制備

       （1）礦物藥及其制劑：除另有規(guī)定外，取供試品適量，取相當于含砷量20～30mg的供試品粉末（過四號篩），精密稱定，精密加入人工腸液適量，置37℃水浴中超聲處理適當時間，搖勻，取適量，靜置約2420～36小時，吸取中層溶液適量，用微孔濾膜（10μm）濾過，精密量取續(xù)濾液適量，用0.02mol/L乙二胺四醋酸二鈉溶液稀釋至一定體積，搖勻，即得。同法制備空白溶液。

       （2）動、植物類中藥（除甲類、毛發(fā)類）：除另有規(guī)定外，取供試品粉末（過三號篩）0.2～0.5g，精密稱定，精密加入硝酸人工胃液適量，置37～45℃水浴中加熱約20～24小時，取出，搖勻，放置2小時，取上清液，用一次性雙層濾膜（10μm+3μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。同法制備空白溶液。

       測定法 分別吸取系列標準曲線溶液和供試品溶液各20～100μl，注入液相色譜儀，測定。以系列標準曲線溶液中不同形態(tài)砷或不同價態(tài)砷的峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算供試品溶液中不同形態(tài)或不同價態(tài)砷的含量，即得。

       【附注】

       ①　所用玻璃儀器使用前均需以20%硝酸溶液（V/V）浸泡24小時或其他適宜方法進行處理，避免干擾。

       ②　本法系汞和砷元素形態(tài)及其價態(tài)的通用性測定方法，在滿足系統(tǒng)適用性的條件下，并非每次測定均需配制3種汞或6種砷的形態(tài)及其價態(tài)系列標準曲線溶液，可根據(jù)實際情況僅配制需要分析的汞或砷形態(tài)及其價態(tài)的系列標準曲線溶液。

       ③　進行汞元素形態(tài)及其價態(tài)分析時，由于色譜柱中暴露的未完全封端硅羥基對Hg²⁺的影響，導致色譜柱柱效損失較快。建議采用封端覆蓋率較高的色譜柱，且必要時，在一定進樣間隔，以采用閥切換技術以高比例有機相沖洗色譜柱后再繼續(xù)分析。

       ④　硝酸人工胃液：取32.8ml稀硝酸，加水約800ml與人工胃蛋白酶10g，搖勻后，加水稀釋成1000ml，即得。

       ⑤　因中藥成分復雜且砷、汞含量差異較大，故本法中稱樣量僅供參考。礦物藥及其制劑的取樣量一般應折算至含砷量或含汞量20～30mg；動、植物類中藥（除甲類、毛發(fā)類）的取樣量應根據(jù)樣品中砷或汞的含量來確定適宜的量，一般為0.2～0.5g。

       ⑥　本法中規(guī)定的供試品溶液制備方法系通用性的推薦方法，實踐中可根據(jù)樣品基質的不同而進行參數(shù)的適當調(diào)整，并在各品種項下另作詳細規(guī)定，同時進行必要的方法驗證。

       ⑦　供試品中汞或、砷形態(tài)或價態(tài)的限量應符合各品種項下的規(guī)定。

       三、2020版《中國藥典》執(zhí)行后展望

       根據(jù)監(jiān)管需要，對標國際先進標準，國家藥典委員會官網(wǎng)發(fā)布了2322《汞、砷元素形態(tài)及其價態(tài)測定法》（第三次征求意見稿），將專屬性強、鑒別力好、成熟度高的檢驗方法納入標準，合理升級了汞、砷元素形態(tài)及其價態(tài)測定標準，該標準的升級為推動中藥材國際標準化發(fā)展將起到較好的引領作用，對提升板中藥材產(chǎn)品的國際影響力和競爭力，推動中藥材產(chǎn)品國際貿(mào)易發(fā)揮重要作用，國家藥監(jiān)部門明確表示，良藥走遍天下，劣藥寸步難行，再次給中藥行業(yè)質量監(jiān)管敲響了警鐘，2020版《中國藥典》的制修訂更接地氣，緊密聯(lián)系監(jiān)管實際，及時滿足監(jiān)管需求，充分體現(xiàn)藥典標準的主要功能作用，即鼓勵好藥，淘汰劣藥，鑒別真?zhèn)?，評判優(yōu)良，更好地為監(jiān)管服務，有關企業(yè)需提前領會汞、砷元素形態(tài)及其價態(tài)測定標準的創(chuàng)新和變化，做到清楚各項標準內(nèi)涵，理解標準內(nèi)容，掌握標準操作，便于今后正確按照升級后標準進行檢驗。

       參考文獻

       [1] www.chp.org.cn/view/ff8080816e444b7f016f180a38d536b0?a=BZFL

       作者簡介：滴水司南，男，生物醫(yī)藥高級工程師，立足于生物醫(yī)藥行業(yè)質量管理工作，專注于生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)，希望在知識的海洋里，用簡單的語言講述不簡單的專業(yè)知識，提供一枚知識的指南針，指引讀者到達知識的彼岸。